大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术影响因素研究

2019-12-03张红徐莹莉黄志银李梅范伟强王超楠

安徽农业科学 2019年21期

张红　徐莹莉　黄志银　李梅　范伟强　王超楠

摘要电泳技术是分子标记辅助育种技术的关键步骤，建立一套高效的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系可提高分子标记辅助育种技术的工作效率。以根肿病抗感大白菜作为试材，以凝胶聚合速度及凝胶条带的清晰度作为衡量标准，分别对电泳中的凝胶浓度、温度、促凝剂配比3个重要因素进行研究。结果发现凝胶浓度、温度、促凝剂配比均与凝胶聚合时间呈现负相关，但4种常用凝胶浓度制胶时间差异不明显，可主要根据目的产物的大小选择浓度。在凝胶质量方面，温度、促凝剂配比与凝胶的脆性呈负相关。综合分析，操作中环境溫度为25～35 ℃，促凝剂配比为1∶10的条件，聚合速度适中，条带清晰，检测效果最佳。

关键词非变性聚丙烯凝胶电泳;凝胶浓度;温度;促凝剂配比;大白菜

中图分类号 S332.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.031

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on Influence Factor of Non Denatured PAGE Technology of Chinese Cabbage

ZHANG Hong1，XU Yingli2，HUANG Zhiyin1 et al

（1.Tianjin Kernel Institute of Vegetables，State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation，Tianjin Vegetable Genetics and Breeding Enterprise Key Laboratory，Tianjin 300381; 2.Life Science College of Tianjin Normal University，Tianjin 300387）

Abstract The electrophoresis technology is the key step in the molecular marker assisted breeding technology.Establishing a set of effective system of modified polyacrylamide gel electrophoresis technology could improve the working efficiency of the molecular marker assisted breeding technology.Taking Chinese cabbage with resistance to club root as test materials，polymerization time to gel and the definition of the gel strips as standards，the concentrations of the gel temperature and ratio of coagulant were studied.Found that the gel concentration，temperature，ratio of coagulant were negatively correlated with gel time，but the differences of gel time by four kinds of commonly used gel concentration were not obvious，we can choose the concentration mainly according to the size of the objective.In terms of gel quality，the temperature and the ratio of coagulant were negatively correlated with the brittleness of the gel.Therefore，comprehensive analysis showed that the polymerization speed was moderate，the strip was clear，and the detection effect was the best when the environmental temperature was 25-35 ℃，the ratio of coagulant promoter was 1∶10.

Key words Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis;Gel concentration;Temperature;The ratio of coagulant;Chinese cabbage

基金项目青年科研人员创新研究与实验项目（2018013，2018003，201913）;天津市现代农业产业技术体系创新团队建设专项计划（ITTVRS2017003）。

作者简介张红（1990—），女，天津人，研究实习员，硕士，从事大白菜分子育种研究。通信作者，副研究员，从事十字花科蔬菜育种研究。

收稿日期 2019-07-25

随着分子生物学与信息学的快速发展，分子标记辅助育种技术（marker assisted selection，MAS）应运而生，它弥补了传统育种周期长、筛选靠经验等不足，不仅大大缩短了新品种的选育进程，降低了选育过程中的工作量，而且从基因水平上确保了筛选的准确性，该技术已被广泛应用于水稻[1]、小麦[2]、白菜[3]、辣椒[4]等农作物及经济作物品种的选育中。分子标记辅助选育过程中关键步骤就是对PCR扩增产物的检测，对于操作者来说，熟练掌握相关检测技术至关重要。目前实验室常用的检测方法主要是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），琼脂糖凝胶操作过程更为简便，初学者较易掌握，但它适用于长度200 bp至近50 kb的DNA，对于小片段DNA的检测分辨率差;聚丙烯酰胺凝胶电泳则适用于高通量的样本检测，对于分离5～500 bp的DNA效果更佳，分辨率更好。黄烈健等[5]认为在进行近等基因系的差异分析时，SSR类型的标记比RAPD标记更具有优势性。而针对SSR类型的分子标记，采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够高效地检测出单拷贝的差异，因此该检测方法在实践应用中选择率更高。但它的操作过程相对更为繁琐，制胶、跑胶、染胶过程影响成败的因素也复杂，国内对此的相关研究主要集中在染胶方法的改进[6]，对制胶影响因素的关注相对缺乏，初入实验室的研究者很难自主掌握规律。

中，凝胶质量最佳。

凝胶浓度、操作环境温度、促凝剂配比等都会影响凝胶聚合速度和凝胶检测效果。该试验从凝胶聚合速度和检测效果出发，综合研究了3个主要因素[14-15]的作用，发现凝胶浓度对聚合时间的影响较小，但它决定着形成分子筛的孔径大小，通过影响目的产物的通过，从而影响检测效果。相比而言，制胶过程中的温度和促凝剂配比对聚合速度及检测效果影响明显，实验室批量操作，建议选择25～35 ℃，APS∶TEMED配比1∶10的试验条件，凝胶聚合时间大约在8 min，不仅能有效缩短制胶时间，而且跑胶读带效果清晰。

47卷21期张红等大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术影响因素研究

参考文献

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