杨勇　杨礼寿　罗忠圣

摘要 为充分利用刺梨果渣中的氮源，利用刺梨果渣作为培养基主料栽培平菇，通过凯氏定氮法，研究不同阶段下培养基的蛋白质含量变化。结果表明，刺梨果渣栽培平菇的生物学转化率为126%，刺梨果渣、刺梨果渣培养基、菌丝长满后培养基、平菇菌丝、子实体、菌糠的蛋白质含量分别为8.05%、9.12%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%。证明刺梨果渣中的氮源可以满足平菇生长的需求。

关键词 刺梨果渣;平菇;凯氏定氮法;蛋白质

中图分类号 S646.1+4文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）21-0051-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.21.016

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Changes of Protein Content in the Cultivation of Pleurotus ostreatus with Roxburgh Rose Fruit Residue

YANG Yong1，2，3，YANG Lishou1，2，LUO Zhongsheng1，2

（1.State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants，Guizhou Medical University，Guiyang，Guizhou  550025;2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang，Guizhou  550014;3.Beijing Youhekang Biomedical Technology Co.，Ltd.，Beijing  100176）

Abstract In order to make full use of the nitrogen source in the fructus rosae roxburghii pomace，fructus rosae roxburghii fruit residue was used as the main material to cultivate Pleurotus ostreatus in the expriment，and then the protein content variables of the medium under different stages were explored by Kjeldahl method.The results showed that the biological transformation rate of Pleurotus ostreatus cultivated Pleurotus ostreatus was 126%.The protein contents of fructus rosae roxburghii pomace，fructus rosae roxburghii pomace medium，mycelium overgrown medium，Pleurotus ostreatus hyphae，fruit body，bacillus were 8.05%，9.12%，12.68%，20.74%，19.90%，and 9.89%，respectively.Experiments have shown that the nitrogen source in the fructus rosae roxburghii pomace could meet the growth requirements of Pleurotus ostreatus.

Key words Epimedium dregs;Pleurotus ostreatus;Kjeldahl method;Protein

基金項目

贵州省科技重大专项“刺梨资源高值化利用技术集成及产业化-刺梨高值化新产品研制及示范”（黔科合重大专项字〔2013〕6006-4）。

作者简介 杨勇（1989—），男，侗族，贵州贵阳人，硕士，从事药物化学研究。通信作者，副主任药师，从事健康产品研究与开发。

收稿日期 2019-04-23

贵州刺梨资源丰富，刺梨中富含维生素与矿物质。何照范等[1]对刺梨果实的营养成分进行分析，发现其果实中含有多糖、有机酸、单宁等成分。刺梨果渣是刺梨果实经榨汁后，所余下的固态部分，包括果皮、果肉、果梗等。贵州省每年榨汁后的刺梨果渣约1 000 t[2]，刺梨果渣中剩余的功能性成分含量仍很高，尤其是脂溶性成分及不溶性成分，如粗蛋白、纤维素、黄酮类、三萜类等，有再利用价值。李达等[3]对刺梨果渣进行了成分分析，发现刺梨果渣中含有水分76.70%、灰分0.86%、总糖4.67%、单宁0.16%、粗纤维11.20%、蛋白质421%。平菇是一种木腐生型的食用菌，具有适应性强、对生长环境要求不高、营养价值高、生产成本低等优点，将刺梨果渣用作平菇栽培，不仅能产生经济效益，同时能解决刺梨果渣带来的环境问题。

凯氏定氮法作为蛋白定量分析的经典方法，该方法易于实现、简单可行，且测试准确度较高，但该方法存在检测过程较繁琐、费时[4]、关键点控制不准等缺陷。特别是手动凯氏定氮法，不仅耗时更长，准确度与精密度受人为操作的影响较大，稳定性、重复性与重现性相对较差。半自动或自动凯氏定氮法，可以减小人为操作误差[5]，缩短定量分析的时间。笔者使用刺梨果渣栽培平菇，通过平菇的生物学转化率分析该栽培方式的可行性;同时用SKD-100自动凯氏定氮仪分别对不同生长阶段的平菇及其培养料中蛋白含量进行测定，分析其蛋白质含量的动态变化。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

刺梨果渣（贵州奇昂生物科技有限公司提供），平菇栽培种（天然产物化学重点实验室提供）;普钙（过磷酸钙与石膏混合物）、石膏、尾矿、石灰粉、重质碳酸钙、玉米面、玉米芯、小麦、马铃薯、麸皮、麦秸秆、阔叶树木屑、棉籽壳;浓硫酸（优级纯）、硼砂（优级纯），硼酸、氢氧化钠、甲基红、溴甲酚氯、30%双氧水、硫酸铜、硫酸钾等试剂均为国产分析纯。

酸式滴定管（北京朋利驰科技有限公司），JKXZ06-20B恒温消煮仪（上海能共实业有限公司），SKD-100自动凯氏定氮仪（上海沛欧分析仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 平菇栽培。分别以通用培养基刺梨果渣培养基分别接种平菇栽培种，平菇栽培方法参照单津津等[6]的方法，栽培出菇后计算平菇的生物学转化率[7]。

1.2.2 蛋白质含量测定

1.2.2.1 试剂配制。试剂配制参照GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》。

1.2.2.2 0.02 mol/L硫酸标准溶液的滴定。采用减重法。准确称量干燥至恒重的优级纯硼砂约100.0 mg，置于100 mL锥形瓶中，加20 mL水溶解，滴加2滴甲基红指示液，用硫酸溶液滴定至粉红色刚出现，小心煮沸溶液至红色褪去[8]，冷却至室温。继续缓慢滴定、煮沸、冷却，直至刚出现的微红色在再加热时不褪色为止。平行测定9组，取平均值作为硫酸标准溶液浓度。

1.2.2.3 样品消解。为保证3种样品消化完全且检测结果能达到凯氏定氮法的最低检出限，精密称取干燥至恒重的供试品粉末各2.00 g[9]，而称取0.5 g平菇菌丝与平菇粉末，分别置于消化管中，加入优级纯浓硫酸10 mL，再加入催化剂粉末（硫酸铜0.05 g，硫酸钾1.5 g），适当摇匀，每个样品平行测定9组。并另取3支消解管，加入等量催化剂和10 mL放入消煮仪中，每一个消解管上放置一个小漏斗，350 ℃消解（从100 ℃升温至350 ℃，防止消解液暴沸），直至消解液澄清略带蓝绿色[10]且无碳化物（约4 h）后，加30% H2O2[11]冲洗消解管管壁，继续消化20～30 min[12]，关闭消煮仪，冷却，用少量水冲洗漏斗[13]和消解管，待测定。

1.2.2.4 蒸馏和吸收。

检查凯氏定氮仪的蒸馏水桶和碱液桶水位（若不足，需补充蒸馏水和400 g/L NaOH溶液），打开冷凝水。取一支消解管，加入适量蒸馏水，放入凯氏定氮仪规定位置，并在吸收导管处放置加蒸馏水的吸收瓶，导管插入液面以下。设置蒸馏时间4 min，加碱时间0 s，冲洗[14]管路4 min，结束后，消解管的温度会降低，吸收瓶的蒸馏水会倒吸入消解管，则证明该管路气密性良好，可以进行蒸馏。

把装有样品的消解管放入凯氏定氮仪规定位置，并在吸收导管处放置盛有40 mL硼酸溶液的锥形瓶作为吸收瓶（加混合显色剂的硼酸作为吸收液），注意导管要接触硼酸液面或液面以下。设置蒸馏时间4 min，加碱时间9 s。当蒸馏时间剩下30 s时，将吸收导管移除吸收液液面（防止吸收液倒吸），继续蒸馏至时间结束。蒸馏结束后，取下消解管和吸收瓶，用少量水冲洗吸收导管下端（没入液面以下部分），洗液一并并入吸收液中，冷却，待滴定。

测试完一种样品，应冲洗一次管路，防止上次试验残留的NH4+干扰[15]下次测试样品的试验结果。

1.2.2.5 滴定。用标定过的硫酸标准溶液滴定吸收液，直至蓝色完全消失，略带灰色为滴定终点。记录消耗硫酸体积，计算蛋白质含量。蛋白质含量计算公式：

X=2（V1-V2）c×141 000 m×F×100%[16]

式中，X为蛋白质含量，%;c为标准硫酸溶液浓度，mol/L;V1为消耗盐酸的体积，mL; V2为空白消耗盐酸的体积，mL; m为称取样品的质量，g; F为氮换算为蛋白质的系数6.25。

2 结果与分析

2.1 平菇生物学转化率

由表1可知，刺梨果渣栽培平菇菌丝长势良好，平菇生物学转化率为126%，高于通用培养基对照组的生物学转化率108%。因此，證明应用刺梨果渣中的碳氮源能满足平菇的生长需求，同时能带来较高经济效益[17]。

2.2 平菇不同生长阶段的蛋白质含量

由图1可知，刺梨果渣、刺梨果渣培养基、菌丝长满时刺梨果渣培养基、菌丝体、平菇、完全出菇过后菌糠的粗蛋白含量分别为8.05%、912%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%。其中二级种原种蛋白质含量最高，药渣中蛋白质含量最低。由于二级种、菌丝、菌糠与栽培底料混合在一起，因此其蛋白质含量与栽培底料的蛋白质含量有直接关系。菌丝的生长需要大量氮源[18]，出菇之后，氮源的需求量减少，可适当调低氮源所占百分比，同时调高碳源的百分比，有利于实现平菇的增产。平菇利用药渣中的氮源，但降解利用之后，菌糠的蛋白质含量并未变低，说明食用菌降解药渣并不能显著改变培养基质物料的蛋白质含量，但药渣的总质量发生了显著改变，说明平菇生长过程中，碳源需求量远高于氮源。

3 结论

刺梨果渣作为一种可循环利用的中药资源，不仅可应用于农业生产，还可以应用于饲料加工、污水处理[19]、有机肥生产等工业方面，具有广泛的应用前景。该试验以刺梨果渣栽培平菇的生物学转化率为126%，平菇蛋白质含量为1990%，营养价值与产率均较高，说明利用刺梨果渣栽培平菇是可行的。此方法不仅实现了对刺梨果渣资源的二次利用，而且可以获得较高的经济效益，既降低了其带来的环境污染，也降低了平菇的生产成本，是一种高效的生态农业[20]模式。

刺梨果渣、刺梨果渣培养基、菌丝长满时刺梨果渣培养基、菌丝体、平菇、完全出菇过后菌糠的粗蛋白含量分别为8.05%、9.12%、12.68%、20.74%、19.90%、9.89%，说明菌丝体生长至出菇前，需要大量的氮源合成生物酶类[21]，在此阶段菌丝体细胞新陈代谢旺盛[22]，调整合理氮源比例，有利于提高菌丝的生长速度[23]和平菇药用活性成分含量[24]，同时降低木霉菌感染[25]的风险，为科学合理地利用植物废渣栽培平菇提供理论依据。