陆建忠，张诗吟

(浙江省湖州市第一人民医院心血管内科 313000)

冠状动脉血管发生动脉粥样硬化使血管腔阻塞或狭窄，或造成缺氧、心肌缺血而引起的心脏疾病，简称冠心病，严重威胁人类健康[1]。在冠心病的病因研究中，约有50%患者发病与吸烟、糖尿病、高血压、肥胖这些危险因素有关[2]。研究表明冠心病新的重要危险因素为同型半胱氨酸(Hcy)水平升高[3-4]，Hcy的水平会受到关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶的基因多态性影响[5-6]。因此，预防冠心病的策略中就包含着降低Hcy水平的方法，而对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)(C667T)基因多态性的研究或许能由遗传学方面探索冠心病发生的原因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年9月至2018年1月至本院心内科住院行冠状动脉造影的患者，共计700例。其中冠状动脉造影证实冠状动脉无明显病变的244例，设为健康对照组；左主干存在30%以上狭窄病变或冠状动脉右冠、左前降支、回旋支存在50%以上狭窄病变患者共计456例，设为冠心病组。纳入标准：年龄40～80岁；均为汉族本市常驻居民。排除标准：半年内使用过治疗冠心病或影响血液Hcy水平的相关药物(他汀、氨甲蝶呤、叶酸、维生素)；合并其他严重心脏疾病患者；根据NYHA分级达到Ⅲ、Ⅳ级的心功能或严重肾功能不全患者；患者有严重的消化、风湿免疫、血液、内分泌、呼吸等其他系统合并疾病。

1.2 检测指标 收集研究对象的吸烟情况、年龄、糖尿病病史、性别等。清晨空腹时抽取患者5 mL静脉血，将抽取的静脉血其中2 mL置入抗凝管内，立即存入冰箱中设置温度为-80 ℃，24 h之内提取基因组DNA；另外3 mL用于检测Hcy、血脂、肝功能、肾功能等生化指标。

1.3 基因组DNA提取与MTHER基因多态性检测 血液中基因组DNA抽取根据DNA试剂盒说明书(上海百傲科技有限公司，产品编号BST03021)操作。DNA由核酸蛋白仪(Nanodrop2000)检测提取，DNA样本保存备用(保存温度设定-80 ℃)。设计MTHER(C677T)基因片段的PCR引物，见表1。

表1 引物信息

PCR反应体系为25 μL，加入含有10 μmol/L的正反引物各0.5 μL和9.5 μL去离子水；12.5 μL PremIxTaq酶、2 μL基因组DNA溶液。95 ℃预变性3 min，(95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)36个循环，72 ℃延伸5 min。对PCR产物纯化后采用HinfⅠ限制性核酸内切酶进行消化。

1.4 冠状动脉造影与病变程度评定 拟行冠状动脉造影检查的患者术前均应进行碘过敏试验筛查及使用适当的抗血栓药物治疗，预防术中严重不良事件比如血栓形成、造影剂过敏等。本研究经桡动脉入路为首选，若桡动脉搏动不够强则检测肱动脉，若搏动良好则以肱动脉为入路，若肱动脉搏动亦不强，则为防止外周围血管闭塞应行上肢动脉超声检查。入路确定后则先进行局部消毒(5%碘伏进行)，铺巾之后进行股动脉、肱动脉、桡动脉穿刺(采用SeldInger技术进行穿刺)，然后放入对应型号管，以多体位投照，完成冠状动脉造影。冠状动脉造影结果由两位经验丰富的临床医师，使用目测法对冠状动脉病变程度、病变血管支数、冠状动脉病变部位进行分析，依据冠状动脉造影结果，将冠状动脉病变程度分为3级：A级主要冠状动脉狭窄程度均小于50%，B级至少一根主要冠状动脉狭窄程度大于或等于50%且主要冠状动脉狭窄程度均小于75%无需手术干预，C级至少一根主要冠状动脉狭窄程度大于或等于75%，需要手术干预(狭窄程度大于或等于75%，但因血管解剖或其他如严重钙化等因素不适合手术干预)。

表2 两组临床资料的比较

2 结 果

2.1 两组临床资料的比较 两组研究对象冠心病组的平均年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)；其他一般资料比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 MTHFR(C677T)基因多态性的检测结果 通过PCR特异性引物，扩增包含MTHFR(C677T)位点的片段，并对获得的PCR产物进行体外HinfⅠ限制性核酸内切酶消化，其中TT纯合型完全酶切后有126、68 bp，TC杂合型完全酶切后有194、126、68 bp，而CC野生型完全酶切后则只有194 bp片段，见图1。对MTHFR(C677T)基因各基因型患者的年龄、性别进行统计分析，其中TT型患者224例，男132例，女92例；CC型患者163例，男92例，女71例；TC型患者313例，男192例，女121例，3种基因型患者性别分布差异无统计学意义(P>0.05)。3种基因型平均年龄差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图1 MTHFR(C677T)基因多态性的检测结果

指标MTHFR(C677T)基因多态性TTCCTCF/χ2P性别[n(%)] 男 132(58.93)92(56.44)192(61.34)1.1020.577 女92(41.07)71(43.56)121(38.66)年龄(x±s,岁)64.8±7.763.3±7.163.7±8.22.0580.129

2.3 不同基因型患者中血清Hcy水平比较 TT基因型患者血清中Hcy水平最高，平均(20.17±8.87)μmol/L，而CC基因型患者血清中Hcy水平最低，平均(12.74±6.68)μmol/L，TC基因型患者血清中Hcy水平平均(14.62±9.55)μmol/L，对3种基因型患者血清中Hcy水平进行单因素方差分析，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步采用LSD-t对两组间差异进行分析发现，CC型、TC型患者血清Hcy平均水平均显著低于TT型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 冠状动脉狭窄程度与血清Hcy的关系 冠状动脉狭窄程度C级患者血清Hcy水平最高，平均(19.84±7.97) μmol/L，而冠状动脉狭窄程度A级患者血清Hcy水平最低，平均(13.48±7.69)μmol/L，冠状动脉狭窄程度B级患者血清Hcy平均(16.79±8.06)μmol/L，采用单因素方差分析比较3组患者血清Hcy水平差异发现，3级患者血清Hcy水平差异有统计学意义(P<0.05)；进一步对3组进行LSD-t检验发现，A、B级患者血清Hcy水平均显著低于C级患者，差异有统计学意义(P<0.05)。将因变量定为是否冠心病，纳入患者糖尿病、性别、高血压、年龄吸烟史及Hcy水平为自变量，进行二元Logistic回归分析，结果显示血清Hcy水平与冠心病的发生相关，但差异无统计学意义(OR=1.079，P<0.05)。见表4。

表4 冠心病发生的危险因素分析

2.5 MTHFR(C677T)基因多态性与冠状动脉狭窄程度的关系 通过秩和检验对患者MTHFR(C677T)基因多态性与冠状动脉狭窄程度进行分析发现，不同基因型患者其冠状动脉狭窄程度差异有统计学意义(Z=183.800，P<0.05)；TT型患者冠状动脉狭窄程度相比于TC、CC型更严重，差异有统计学意义(Z=9.951、12.930，P<0.05)；TC型患者冠状动脉狭窄程度相比于CC型更严重，差异有统计学意义(Z=4.766，P<0.05)。见表5。以是否冠心病为因变量，纳入患者糖尿病、性别、高血压、年龄吸烟史及MTHFR(C677T)基因多态性为自变量，进行Logistic回归分析，结果显示MTHFR(C677T)基因TT型和TC型与冠心病发生相关，但并不显著(OR=1.240，P>0.05；OR=1.022，P>0.05)。见表6。

表6 是否患有冠心病

*：与CC基因型比较

3 讨 论

Hcy属于人体内一类含硫氨基酸，其本身不参与蛋白的生物合成，而是代谢过程中的产物[7]。Hcy代谢的异常会促使动脉血管平滑肌细胞增生，提高血小板黏附能力，同时激活凝血因子，导致各种心血管疾病的发生；同时还会致使机体产生氧化应激，抑制一氧化氮的合成，造成血管内皮细胞损伤[8]。有研究证实，心肌梗死与高Hcy血症发生关系十分密切，冠状动脉血管病变与血清中Hcy水平呈正相关[9]；MAHALLE等[10]通过对300例患有冠心病的印度人群进行研究发现，在患有糖尿病及高血压的冠心病患者中Hcy水平显著增高，并且证实高Hcy是心血管疾病的危险因素。0一些对中国南方冠心病患者的研究得出了与其一致的结论[11]。本研究结果显示，对照组血清Hcy水平显著低于冠心病组，差异有统计学意义(P<0.05)；根据冠状动脉狭窄程度的高低，将患者分为A级、B级和C级，随着冠状动脉狭窄程度的加深，血清Hcy水平逐渐升高，3组相比差异有统计学意义(P<0.05)；进一步分析冠心病发生的危险因素发现，除性别、年龄、高血压、糖尿病、高脂血症及吸烟史外，Hcy也是冠心病发生的独立危险因素(OR=1.079，P>0.05)。

MTHFR维持机体蛋氨酸和叶酸正常的代谢过程，从而保证机体Hcy的正常水平[12]。MTHFR(C677T)基因突变会导致原编码的丙氨酸被缬氨酸取代，同时在基因组上产生HinfⅠ限制酶识别位点，致使MTHFR催化活性降低，从而提高血清Hcy水平，引发高半胱氨酸血症等其他代谢类疾病。RAJNEESH等[13]对北印度地区660例人群(其中331例正常对照与329例冠心病患者)进行研究发现，MTHFR(C677T)位点处T等位基因频率在冠心病患者中明显高于健康对照组，他们认为MTHFR(C677T)等位基因变异提高了冠心病发生风险。本研究发现，TT基因型患者血清中Hcy水平最高，CC基因型患者血清中Hcy水平最低，这与文献[14-15]研究结果一致；MTHFR(C677T)基因多态性与冠状动脉狭窄程度及冠心病的发生十分相关，在TT型中，冠状动脉狭窄程度A级21例，B级49例，C级154例；在TC型中，冠状动脉狭窄程度A级97例，B级151例，C级65例；而在CC型中，冠状动脉狭窄程度A级98例，B级45例，C级20例；不同基因型患者，其冠状动脉狭窄程度差异有统计学意义(P<0.05)，其中TT型患者冠状动脉狭窄程度最严重；以是否患有冠心病为因变量进行回归分析发现，相比于CC基因型，TT及TC基因型均是冠心病发生的危险因素(OR=1.240，P>0.05；OR=1.022，P>0.05)。

本研究局限性在于回归分析结果OR值风险比值较低，比较并不显著，而P值部分具有显著性差异，其原因一方面与总体样本量过少，使估计结果不稳定，产生大的标准误，使本来可能有意义的变量变得无统计学意义。根据文献[16]报道，如果样本小于100，Logistic回归分析的最大似然估计就有风险，样本含量还依赖于变量个数和数据结构等条件，另一方面则与变量类别如吸烟、高血压和高血脂等例数较少所致。综上所述，在湖州市汉族人群中，血清Hcy水平及MTHFR(C677T)基因变异与冠状动脉狭窄程度相关，其中高水平Hcy及MTHFR(C677T)TT与TC基因型均可能是冠心病发生的危险因素。