莫正英,王凤琴,艾淑颖

(湖北省十堰市太和医院/湖北医药学院附属太和医院肿瘤科 442000)

随着检测水平的提高，越来越多的癌症被确诊。在非传染性疾病中，癌症已经成为致死率非常高的疾病。其中肺癌在全球的发病率很高，每年大约有180万人被诊断为肺癌。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中后者占到整个肺癌患者的80%～85%。近年来，肿瘤的治疗手段有了很大的进步，有很多新的治疗靶点被发现，但是由于肺癌具有高的侵袭性和转移性，其疗效一直不能令人满意。因此，深入研究其分子机制将极大推动新的、有效的治疗手段的应用[1-3]。研究证实，肿瘤微环境对肿瘤细胞的生长、侵袭及转移等生物学行为有非常大的影响作用。血小板反应素-4(TSP-4)属于基质细胞(ECM)蛋白家族成员，是一种胞外钙结合蛋白，调节细胞和基质之间的反应，在细胞侵袭、转移、黏附和结合方面发挥着重要的作用[4-5]。现有的一些证据表明，在组织重构和生长中，TSP-4可能发挥了重要作用。并且，在前列腺癌、乳腺癌及消化道肿瘤中发现，TSP-4在肿瘤细胞侵袭、转移、黏附和附着中也起着重要的作用[4-5]。但是，其在肺癌中是否会导致肺癌细胞的转移和侵袭还不是很清楚。本研究研究了TSP-4在肺癌细胞系中的作用，通过加入重组蛋白和siRNA的方法证实了TSP-4能够促进肺癌细胞的转移和生长并且能够促进肺癌细胞的侵袭，提示TSP-4可能是治疗肺癌的一个潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及试剂 肺癌A549、H292细胞购自中国科学院上海生命科学研究所，培养基为RPMI-1640，含10%胎牛血清(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素，于37 ℃、5% CO2、95% 湿度的CO2培养箱中培养。重组TSP-4蛋白购自美国Biovision公司。siRNA由上海吉玛生物技术有限公司设计和合成。LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT增殖实验 将经过不同水平TSP-4处理的A549及H292细胞以1.5×105个/毫升单细胞混悬液以100 μL每孔接种于96孔板中，每孔200 μL，每组设5个复孔，没经过蛋白处理的细胞作为对照；将培养板置入培养箱中培养，培养结束后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃继续孵育4 h，然后每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，摇床振荡使结晶物充分溶解；选择490 nm波长，在酶标仪上检测各孔吸光度，根据后面的公式计算细胞增殖率。增殖率=(检测孔平均A值/对照孔平均A值)×100%。

1.2.2 细胞迁移实验 A549及H292细胞的迁移能力用 xCELLigence 系统来检测(美国ACEA Biosciences公司)。 将细胞用含2%血清的DMEM培养基混匀后取200 μL 细胞悬液轻轻加入CIM-16 plate的上室，且上室中加入TSP-4，不加TSP-4的作为对照。在下室中加入含10%血清的DMEM培养基。细胞的迁移率通过检测上下小室的生物电阻来计算。使用xCELLigence RTCA MP 仪器与RTCA软件1.2进行CI值测定，对细胞持续监测72 h。

1.2.3 细胞侵袭实验 TSP-4对肺癌细胞的侵袭能力通过3D球体细胞侵袭分析试剂盒检测。成球和侵袭基质成分的准备按照说明书的要求操作。用DMEM和成球基质混合细胞，在3D球培养板的每个孔中加入5×102个细胞，在4 ℃条件下，200 g离心3 min。将培养板放入37度孵育72 h，让球体形成。在加入侵袭基质之前，在4 ℃条件下，300 g离心5 min。然后将培养板放入37 ℃，孵育1 h，促进侵袭胶的形成。在孔中加入1 μmol/L的TSP-4,每48 小时记录成球的图像。图像用Image J软件进行分析。

1.2.4 siRNA干扰 靶向TSP-4基因的特异性siRNA序列为：正义链5′-GGC AGU UCU UGG GUC AAA UTT-3′，反义链3′-AUU UGA CCC AAG AAC UGC CTT-5′。对照siRNA的序列为：正义链5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反义链 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。 合成的siRNA粉末溶解在RNase Free dH2O中，配制成20 mmol/L储存液分装保存，按照转染试剂说明书进行转染。转染前1 d，将A549细胞传代于6孔板中培养，细胞密度应能在24 h内使细胞汇合达到70%～90%。按LipofectamineTM2000 Reagent说明书进行转染。转染后6～8 h更换含血清的完全培养液培养。

1.2.5 Real-time PCR 将实验分为3组，TSP-4-siRNA 转染组、空siRNA(NC-siRNA)转染组及未转染组。每组至少3个重复。分别提取各组转染后48 h细胞总RNA，总RNA进行反转录成cDNA，通过实时定量PCR扩增目的基因。反应体系为20 μL，其中SYBR Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸20 s，反应40个循环。采用2-△△Ct法分析目的基因mRNA的相对表达水平。扩增基因的特异性引物序列为：GAPDH：5′-ATC ATC AGC AAT GCC TCC TG-3′(正向)，5′-ATG GAC TGT GGT CAT GAG TC-3′(反向)TSP-4：5′-GTT GCA GAA CCT GGC ATT CAG-3′(正向)，5′-CCC TGG ACC TGT CTT AGA CTT CA-3′(反向)。

1.2.6 Western blot 实验分组同上，转染48 h后，提取各组蛋白，测定蛋白水平。取各组等量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育后显影。所加一抗分别为TSP-4(1∶500)及b-Actin(1∶1 000)。将所得结果进行分析。

2 结 果

2.1 TSP-4对肺癌细胞增殖的影响 在TSP-4水平为10 μmol/L的条件下，对细胞产生了最大的促进作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。并且随着TSP-4水平的增加，对细胞的促进效率也增加。

2.2 TSP-4对肺癌细胞的迁移能力的影响 在用TSP-4孵育细胞72 h后，在10 μmol/L水平条件下，能显著增强细胞的迁移(P<0.05)。见图 2。

A： A549细胞；B:H292细胞

图1 TSP-4对肺癌细胞增殖的影响

2.3 TSP-4对肺癌细胞侵袭能力的影响 与0 μmol/LTSP-4比较，10 μmol/L的TSP-4显著增强了细胞的侵袭能力。0 μmol/L TSP-4的细胞第7天细胞球大小没有明显变化。而加入10 μmol/L TSP-4的细胞第7天形成的细胞球明显增大，侵袭性明显增加。见图3。

A：A549细胞；B:H292细胞

图2 TSP-4对肺癌细胞迁移能力的影响

2.4 转染siRNA后A549细胞中TSP-4 mRNA水平和蛋白水平的变化 转染48 h后，分别提取各组A549细胞的RNA进行检测，验证其干扰效果，TSP-4-siRNA转染组(0.62±0.09)较NC-siRNA组(1.12±0.04)及未转染组(1.15±0.07)A549细胞中TSP-4 mRNA水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后，提取各组细胞的蛋白进行Western blot检测，TSP-4蛋白相对表达强度各组分别为TSP-4-siRNA 转染组0.30±0.05，NC-siRNA 组0.65±0.03，未转染组0.62±0.04；与NC-siRNA组及未转染组比较，TSP-4-siRNA转染组细胞中TSP-4蛋白水平下降。见图4。

2.5 转染siRNA后A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化 转染成功后，TSP-4-siRNA转染组对肺癌细胞的促进率(25.30±1.45)%相对未转染组(81.67±3.76)%明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，转染成功后，TSP-4-siRNA转染组对肺癌细胞的迁移和侵袭能力相对未转染组明显降低(P<0.01)。见图5。

A：TSP-4基因蛋白表达水平；B:TSP-4基因mRNA表达水平

图4转染后各组A549细胞TSP-4蛋白和mRNA的表达

A：增殖影响；B：迁移影响；C:侵袭能力影响

图5转染siRNA后对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

3 讨 论

肺癌在中国是常见的恶性肿瘤，且病死率很高。目前肺癌的治疗以手术切除为主，辅以放化疗等其他治疗手段，虽然在一定程度上缓解了病情，但总体的疗效不满意，复发率高，预后差。造成这种结果的原因是肺癌具有高度的侵袭性，使得肺癌细胞很容易侵袭转移到其他的组织中去。因此，研究肺癌的侵袭转移机制对指导肺癌的治疗有重要意义。

TSPs是一类多功能蛋白质家族，参与多种生物学过程的调控[6]。TSP-1是第1个被发现的TSPs家族成员，参与抑制肺癌和膀胱癌中的血管生成从而抑制肿瘤生长，但在乳腺癌和胰腺癌中的作用相反[7]。TSP-4是结构上不同于TSP-1的多功能细胞基质糖蛋白，其相对分子质量为550×103，由每端带有球型结构域的5个亚基组成，参与调控关键的细胞生理过程，包括细胞增殖、黏附及侵袭，细胞骨架重构，细胞与细胞的相互作用等[8-9]。现有的研究证实，TSP-4和肿瘤相关，尤其是在乳腺癌中研究的较多[10-11]；但是这种参与肿瘤发生的机制了解的并不是很清楚[12]，仍需要很多工作去探究。

TSP-4参与调节肿瘤的发生、发展，尤其在一些肿瘤中能够增强肿瘤细胞的转移、侵袭及内皮细胞管的形成。LIN等[4]报道，在人的胃癌中，TSP-4的表达和肿瘤大小、TNM分期相关；MCCART等[5]发现，在乳腺癌胞外基质中，TSP-4的高表达激活基质细胞的反应，促进肿瘤细胞的侵袭。但是，TSP-4的表达水平和肺癌的发生、发展之间的关系仍然是不清楚的。本研究发现了TSP-4能促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力，表明TSP-4在肺癌的发生、发展中起重要的作用。并且通过siRNA干扰技术，下调肺癌细胞中TSP-4的表达，观察TSP-4水平降低对肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果显示，TSP-4表达明显下降，A549细胞的侵袭、迁移和增殖能力均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。表明抑制TSP-4表达可明显降低肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

肺癌的侵袭、迁移是涉及多基因改变、多因素参与的复杂生理过程[13]。本研究中的TSP-4可能是参与肺癌侵袭、迁移的调控因素之一，其他的因素也参与其中。而且，TSP-4是否参与调节肿瘤血管生成有待进一步研究证实，且其机制是否与其具有调控血管内皮细胞的增殖和迁移功能，需要进一步研究。因此，TSP-4可能在肺癌发生和发展中起重要的作用，但确切的作用及机制还有待更多深入的研究。