李悦悦，章 斌，原永芳

(上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海 200011)

防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的未抽花茎植株的干燥根。味辛甘，性温，能解表祛风、胜湿、止痉。用于感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒和破伤风。药理实验研究表明，其具有解热、镇痛、镇静、抗炎、抗过敏、抗惊厥等作用[1-4]。其主要成分包括挥发油、色原酮类、有机酸、香豆素类、聚炔类、多糖类等化合物[5-8]，但其药效物质基础尚不明确，本课题组前期研究[9]运用HPLC-TOF-MS技术研究了防风入血原型成分，但未寻找血液中防风代谢产物，且仅对化合物进行了初步推断。本实验首次采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术鉴定大鼠血浆中防风的入血成分及代谢产物，共鉴定了大鼠血浆中21个来源于防风的化合物，包括10个入血原型成分和11个代谢产物，并推测其入血成分的代谢途径，为进一步研究防风的药效物质基础及作用机制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity液相色谱系统、Agilent6530 Accurate-Mass Q-TOF-MS串联四极杆-飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源(美国安捷伦公司)；Masshunter Qualitative Analysis质谱分析软件，高速低温离心机(美国Therma公司)。

1.2 材料

防风药材产自内蒙古，购自上海德康大药房，并由第二军医大学药学院生药学教研室孙连娜副教授鉴定为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根。分析用水均使用超纯水，甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯。所有的溶剂和样品在进入高效液相色谱之前均经过0.22 μm纤维滤膜滤过。

雄性Wistar大鼠，体质量(180±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK(沪)2007-0005。采用代谢笼法(每笼1只)饲养于第二军医大学药学院动物房，室温22℃，湿度72%，12 h昼夜交替，自由采食、饮水。实验前禁食 12 h。

2 方法

2.1 防风水煎液的制备

称取防风饮片500g，粉粹后于5 L水(10倍水量)中浸泡1 h，煮沸后煎煮1 h，趁热滤过，药渣再加水煎煮1 h后滤过，合并2次滤液，浓缩至1.4g/ml,为灌胃给药用防风水煎液。将其稀释200倍，0.22μm 微孔滤膜滤过，按“2.4”项下色谱条件测定。

2.2 动物给药与血浆样品采集

4只雄性Wistar大鼠，给药前禁食12 h，自由饮水。实验前先经眼眶静脉取血0.2 ml(空白对照)，然后以21g/kg剂量防风水煎液给大鼠灌胃，参照防风色原酮类成分的药动学特征[10]分别于给药后10、30、60、120、240 min，从大鼠眼眶取血0.2 ml，2800×g离心10 min后，分离血浆，置-80℃冰箱保存。

2.3 血浆样品处理

加300μl乙腈至100μl血样中，涡旋3 min，于10400×g高速离心5 min，取上清，等量混合不同时间点血样上清，氮气吹干(35℃)，然后复溶于100 μl甲醇，10400×g高速离心3 min，取上清3 μl进样分析。

2.4 色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm，Agilent)；柱温25 ℃，流速0.3 ml/min，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脱程序：0～5 min，5%～30% B；5～10 min，30%～40% B；10～16 min，40%～95% B；16～18 min，95% B；进样量3 μl。

质谱条件：采用正、负离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压正、负离子模式下分别为4 000 V和3 500 V、干燥气流速11 L/min、干燥气温度350 ℃、喷雾气压45 psig、碎裂电压120 V、Skimmer电压60 V、数据采集范围m/z100～1100，选取m/z121.0509和m/z922.0098的内标离子作实时质量数校正。进一步对防风入血成分和代谢产物离子进行MS/MS分析，碰撞能量根据分子量调节。

3 结果与分析

运用UPLC-Q-TOF-MS技术，通过比较防风水煎液、空白血浆和大鼠灌胃防风水煎液后的血浆图谱，获得入血原型成分及代谢物。对于有对照品的化合物，通过与对照品比对保留时间、特征碎片离子来确定其结构及分子式，对于无对照品的化合物，根据文献及碎片离子信息来确定其结构及分子式。最终在大鼠血浆样品中分析鉴定出10个入血原型成分和11个代谢产物，具体见表1所示；正离子模式下总离子流图(TIC)见图1所示。

3.1 入血原型成分的鉴定

图1的离子峰1、5、7、13、14、17、18、19、20和 21与相应对照品及防风水煎液谱图的保留时间比较，并比对相应碎片离子信息，分别鉴定为防风的原型成分腺苷、divaricatacid、升麻苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、去甲升麻素、(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羟基-8-羟甲基-3,4-二氢-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]双吡喃-6-酮、5-O-甲基维斯阿米醇、亥茅酚苷和紫花前胡苷元；峰7的保留时间(tR=4.998 min)与升麻苷对照品的保留时间(tR=5.024 min)相近，其准分子离子峰为[M+H]+m/z为469.1726，其碎片离子基峰为脱去一分子糖[M+H-C6H10O5]+的m/z为307，与升麻素[M+H]+的m/z一致，因此峰7鉴定为升麻苷。峰 13 的保留时间(tR=5.943 min)与升麻素对照品的保留时间(tR=5.952 min)相近，其[M+H]+的m/z为307.1171，碎片离子289、259、235、221、205和177与升麻素对照品碎片离子一致，参考文献报道[8]，推测其裂解规律如图3所示，峰 13鉴定为升麻素。峰14的保留时间(tR=6.025 min)与5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品的保留时间(tR=6.029 min)相近，其准分子离子峰[M+H]+的m/z为453.1740，其主要碎片离子为脱去一分子糖[M+H-C6H10O5]+后m/z为291，与5-O-甲基维斯阿米醇[M+H]+的m/z一致，其他碎片离子273，243，219，205，189与5-O-甲基维斯阿米醇一致，因此峰14鉴A.ESI+模式定为5-O-甲基维斯阿米醇苷。峰17、18为同分异构体，tR分别为7.290和7.725 min，[M+H]+的m/z为293.1025，均具有碎片离子275[M+H-H2O]+、221[M+H-C4H8O]+，与防风水煎液图谱对比，结合化合物Clog P值，推断峰17和18分别为去甲升麻素和(3S)-2,2-二甲基-3,5-二羟基-8-羟甲基-3,4-二氢-2H,6H-苯并[1,2-b:5,4-b’]双吡喃-6-酮(Clog P值分别为0.9053和1.1753)。峰19的保留时间(tR=7.817 min)与5-O-甲基维斯阿米醇对照品的保留时间(tR=7.822 min)相近，其[M+H]+的m/z为291.1231，其碎片离子273[M+H-H2O]+、243[M+H-H2O-2CH3]+、219[M+H-C4H8O]+、205[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+、189[M+H-H2O-2CH3-C3H2O]+和161[M+H-H2O-2CH3-C3H2O -CO]+与升麻素有相似的裂解规律，说明与其具有相同的呋喃色原酮母核结构，因此，鉴定其为5-O-甲基维斯阿米醇。峰5(tR=4.831 min)的[M+H]+的m/z为321.0974，其碎片离子303[M+H-H2O]+、273[M+H-H2O- 2CH3]+、249[M+H-C4H8O]+、235[M+H-H2O-2CH3-C3H2]+亦符合呋喃色原酮类化合物的裂解规律，因此，推断其为divaricatacid。峰20的保留时间(tR=7.887 min)与亥茅酚苷对照品的保留时间(tR=7.892 min)相近，[M+H]+m/z为439.1606，其碎片离子277、259、205与亥茅酚苷对照品一致，因此鉴别峰20为亥茅酚苷。峰21(tR=7.961 min)的[M+H]+m/z为247.0963，其碎片离子229[M+H-H2O]+、187[M+H-H2O-C3H6]+，与文献报道的紫花前胡苷元碎片离子相同，因而推断其为防风的香豆素类成分紫花前胡苷元。

图1 防风水煎液大鼠体内成分提取离子流图下防风水煎液; B.ESI+模式下空白血浆; C.ESI+模式下给药防风水煎液大鼠血浆； D.ESI-模式下空白血浆；E.ESI-模式下给药防风水煎液大鼠血浆

表1 防风在大鼠体内的入血成分及代谢产物

图2 正离子模式下升麻素质谱碎片信息

图3 升麻素可能的质谱裂解途径(┐H+ 表示[M+H]+)

图4 升麻素的代谢途径

3.2 代谢物的鉴定

防风的主要入血成分为色原酮类化合物，其代谢途径主要包括氧化、还原、水解、葡萄糖醛酸化等。以升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇为例，说明其主要代谢物的鉴别和体内代谢途径。

3.2.1升麻素的体内代谢物

峰2、3、4和9的分子式均为C16H18O7(相对分子质量322.1053，[M+H]+的m/z分别为323.1122、323.1127、323.1120和323.1133)，其tR依次为4.291、4.57、4.652和5.241 min。与升麻素(C16H18O6)相比，增加了16[M+O]+，根据精确相对分子质量及误差，可以推测峰2、3、4和9均为升麻素的羟基化代谢物。峰2的产物离子305比升麻素的碎片离子289多16质量数[289+O]，而碎片离子m/z259、235和221和升麻素的碎片离子相同，说明其羟基在2’-或5’位。峰3与峰2的碎片离子相同，无法根据碎片离子区分峰3与峰2；通过Chemdraw软件计算其Clog P值，峰2与峰3分别为-0.8591和-0.7565，由此推断峰2与峰3分别为2’-羟基升麻素和5’-羟基升麻素。峰4的产物离子275比升麻素的碎片离子259多16质量数[259+O]，说明其羟基在3’-或8位。峰9具有与峰4相同的碎片离子247[M-H2O-2CH3-CO]、232[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，结合Clog P值(3’-羟基升麻素和8-羟基升麻素分别为-0.3647和-0.0188)，推断峰4和峰9分别为3’-羟基升麻素和8-羟基升麻素。峰8[M+H]+的m/z为483.1498，与升麻素相比，增加了176[M+C6H8O6]，且其碎片离子307、289、259和235与升麻素的分子离子峰及碎片离子相同，可以推测峰8为升麻素-O-葡萄糖醛酸苷。升麻素的代谢途径见图4所示。

3.2.25-O-甲基维斯阿米醇的体内代谢物

峰10、11、15和16的分子式均为C16H18O6(相对分子质量306.1103，[M+H]+的m/z分别为307.1183、307.1183、307.1184和307.1165)，其tR依次为5.547、5.772、6.23和6.745 min。与5-O-甲基维斯阿米醇(C16H18O5)相比，增加了16[M+O]+，根据精确相对分子质量及误差，可以推测峰10、11、15和16均为5-O-甲基维斯阿米醇的羟基化代谢物。峰16具有碎片离子259[M-H2O-2CH3]和235[M-C4H8O]，比5-O-甲基维斯阿米醇碎片离子243、219分别增加了16[M+O]+，另有231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，因而推断峰16为8-羟基-5-O-甲基维斯阿米醇。峰15的产物离子包括259[M-H2O-2CH3]、231[M-H2O-2CH3-CO]和216[M-H2O-2CH3-CO-CH3]，推断其为3’-羟基-5-O-甲基维斯阿米醇。峰10与峰11的碎片离子相似，包括289[M-H2O]、271[M-2H2O]、231[M-H2O-2CH3-CO]，通过Chemdraw软件计算5-O-甲基维斯阿米醇的2-羟基、5-羟基、3-羟基和8-羟基代谢物的Clog P值分别为0.6779、0.7806、1.1723和1.5081，因而推断峰10和峰11分别为2-羟-5-O-甲基维斯阿米醇和5-羟基-5-O-甲基维斯阿米醇。峰6在负离子模式下[M-H]-的m/z为275.0926，与5-O-甲基维斯阿米醇(C16H18O5)相比，减少了14[M-CH2]-，另有碎片离子260、245、217，推断其为脱甲基-5-O-甲基维斯阿米醇。

4 讨论

运用UPLC-Q-TOF-MS技术，可以从复杂的生物样品中得到无干扰的代谢产物的质谱信息。本实验采用该技术，通过与对照品、防风水煎液图谱比对，分析代谢产物的碎片离子，鉴定了大鼠血浆中防风的入血成分和代谢产物；共检测到10个入血原型成分和11个代谢产物。防风入血成分的主要代谢途径包括羟化、去甲基和葡萄糖醛酸化。本研究为首次利用UPLC-Q-TOF-MS技术对防风体内成分进行研究，为防风药效物质的寻找奠定了基础。