刘兴国　白雯静　田妮娜　李岩　刘荔

【摘 要】目的：探讨不同种属红细胞在溶血实验中替代动物实验方面的差异性。方法：选用20批次洗发剂进行家兔眼刺激实验，使用同批次样品进行两种不同哺乳动物红细胞溶血实验，根据各自不同的分级标准，将红细胞溶血试验与动物实验进行相关性分析。结果：按照相应的分级标准，绵羊红细胞溶血实验对比分析结果：Kappa=0.426，Spearman相关系数为0.598，猪红细胞溶血实验对比分析结果：Kappa=0.531，Spearman相关系数为0.464。两种动物红细胞溶血试验结果对比分析结果，Kappa=0.358，Spearman相关系数为0.413。结论：实验结果说明两种实验方法有一定的相关性，红细胞溶血实验能在一定范围内取代兔眼刺激实验，且红细胞种属不影响实验结果。

【关键词】化妆品;眼刺激性实验;替代方法;红细胞溶血实验

中图分类号： S481.1文献标识码： A文章编号： 2095-2457（2019）32-0232-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.32.109

A Comparative Study of Different Hemolysis Experiments Instead of Rabbit Eye Stimulation Experiments

LIU Xing-guo BAI Wen-jing TIAN Ni-na* LI Yan LIU Li

（Lanzhou institute for food and drug control， Lanzhou Gansu 730050，China）

【Abstract】Objective： To explore the differences of red blood cells of different species in the hemolysis experiment instead of the animal experiment. Methods： 20 batches of shampoo were selected for rabbit eye irritation test， and the same batch of samples were used for red blood cell hemolysis test of two different mammals. According to different grading standards， the correlation between red blood cell hemolysis test and animal experiment was analyzed. Results： According to the corresponding grading standards， the comparative analysis results of sheep red blood cell hemolysis test： Kappa=0.426， Spearman correlation coefficient 0.598， and pig red blood cell hemolysis test： Kappa=0.531， Spearman correlation coefficient 0.464. The comparative analysis results of erythrocyte hemolysis test results of the two animals showed that Kappa=0.358 and Spearman correlation coefficient was 0.413. Conclusion： The experimental results show that there is a certain correlation between the two experimental methods. Red blood cell hemolysis test can replace rabbit eye stimulation test in a certain range， and the red blood cell species does not affect the experimental results.

【Key words】Cosmetics; Eye irritation test; Alternative methods; Erythrocyte hemolysis test

兔眼刺激性试验（Draize 试验）是指动物眼球接触到化学物质产生炎症反应的过程，是目前评估眼刺激性的金标准[1-2]，通过实验人员肉眼观察血红蛋白的漏出和变性进行评分，方法周期长、成本高，存在一定的主观性和差异性;同时，随着动物保护运动的兴起和人们對“3R”运动的关注[3]，体外替代试验的研究已广泛开展[4-7]。

本研究拟通过20批次洗发类产品验证考察红细胞溶血试验实验用于此类化妆品眼刺激性评价的可能性及不同种属血样的差异性。

1 材料与方法

1.1 样品

全部样品均来源于兰州市药品检验所送检的化妆品，共20个批次样品，均为洗发类。

1.2 绵羊红细胞悬液、猪红细胞悬液购自北京博尔西科技有限公司，100mL/瓶，其中红细胞浓度为2×108个/mL，4℃条件下保存，1个月内使用。

1.3 实验动物

新西兰大耳白兔，普通级，雌雄兼用，雌性未孕，购自兰州畜牧兽医研究所，并饲养在兰州市食品药品检验所药理室普通级动物房。实验动物合格证：SCXK（甘）2015-0001号。

1.4 主要仪器及试剂

主要仪器：艾本德紫外分光光度计BioSpectrometer basic，低温高速离心机Centrifuge5424R，电子天平 MS205DU，控温摇床KS4000。PBS（Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，NaCl8g，KCl0.2g，溶于1000ml纯化水中，pH为7.4，121℃灭菌30min），十二烷基硫酸钠（SDS）（1000mg/L）。

1.5 红细胞溶血实验

先进行预试验预测样品的HD50范围。样品用PBS配制成浓度为10000mg/L（w/v）的贮备液，超声振荡使其完全溶解。取不同浓度的样品溶液（逐级稀释贮备液至1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L）。取不同浓度的受试样品溶液、PBS、0.01%十二烷基硫酸钠、蒸馏水各1.5mL于试管内，分别各加入0.5mL绵羊红细胞悬液、猪红细胞悬液充分混匀。在32℃水浴中振荡孵育30min，然后以10000r/min的速度离心2min，取上清液，分别读取540nm、560nm、575nm波长下的吸光度（A）。以560nm的Abs计算溶血率（HR）：HR=A受试管/A全溶管×100%，预测受试样品导致半数红细胞溶血的浓度范围，以指导正式实验时样品浓度的设置。根据预试结果调整各受试样品浓度。正式实验时设置5个样品浓度，实验方法同预实验。溶血率的计算同预实验，并计算血红蛋白变性指数（DI）=R样品/RSDS×100%，R样品、RSDS分别为样品和SDS上清液A575/A540值。主要观察指标：50%红细胞发生溶血时的样品浓度（HD50）、蛋白质变性指数（DI）、HD50与变性变性指数DI的比值（IP=HD50/DI）。

家兔眼刺激实验按《化妆品卫生规范》（2007）对受试样品进行眼刺激性分级[8]。

1.6 统计方法

以受试样品浓度为横坐标，溶血率为纵坐标作直线回归，根据直线回归方程计算导致50%红细胞溶解时的样品浓度（HD50值），同时计算DI和IP。应用SPSS22.0统计软件分析数据。以兔眼刺激性实验结果为参照标准，进行Kappa检验和Spearman相关系数的计算，检验水准α=0.05，红细胞溶血实验刺激性分级结果和动物实验分级结果进行比较，判断两种实验结果分级的频数差别是否存在统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞溶血实验结果

红细胞溶血实验的分级为：IP≥100、10≤IP<100、1≤IP<10、0.1≤IP<1和IP<0.1分别表示无刺激性、微刺激性、轻刺激性、刺激性和严重刺激性5个级别[9]。溶血率与样品浓度存在一定的线性关系，以样品浓度（mg/L）为横坐标，溶血率为纵坐标可求得HD50值（R2≥0.95）。同时求得HD50时的 DI 和IP。

2.2 兔眼刺激性实验结果

分级标准为无刺激性、微刺激性、轻刺激性、刺激性和严重刺激性5个级别。20批洗发剂中，等级为无刺激性的样品11种，微刺激性样品7种，轻刺激性2种。

3 统计分析

（1）绵羊红细胞溶血实验结果和兔眼刺激性实验结果进行统计分析，Kappa=0.426，认为两者分级一致性尚可;Spearman相关系数为0.598，说明两者之间存在一定的相关性。

（2）猪红细胞溶血实验结果和兔眼刺激性实验结果进行统计分析，Kappa=0.531，认为两者分级一致性尚可;Spearman相关系数为0.464，说明两者之间存在一定的相关性。

（3）两种动物红细胞溶血试验后结果进行统计分析，Kappa=0.358，两者分级相对一致;Spearman相关系数为0.413，两者之间存在一定的相关性。

4 讨论

红细胞溶血实验作为动物实验的一种替代方法，虽然具有一定的局限性，但仍不失为一种可靠性较高的组合策略之一。其本质为化学物质对细胞膜的破坏从而引起一系列的炎性反应。不同结构化合物损伤红机制有较大差异，这就限制了该实验的应用范围。本实验选择溶血和血红蛋白变性两个检测指标，采用2种哺乳动物红细胞进行溶血实验，并进行兔眼刺激性实验，探讨红细胞溶血实验替代传统眼刺激实验用于化妆品眼刺激性评价的可靠性，并对血液来源种属差异是否会对眼刺激替代实验的结果造成影响进行了初步评估。结果显示，两种方法的实验结果在一定刺激性范围内存在相当的一致性，表明可作为化妆品眼刺激性的评价的初筛手段，两种种属红细胞替代实验与兔眼刺激性实验结果的一致性和相关性程度接近，故认为红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验不存在种属差异。

红细胞溶血实验简单快速，具有较好的眼刺激性预测能力，作为化妆品眼刺激性的筛选策略，是一种比较有潜力的离体替代方法，也很有可能成为替代实验的组合实验中的重要组成部分，将来如能加强在比色方面的研究，有希望成为一种可靠地快速检验方法。本研究中遇到的问题以及方法的局限性：溶血实验过程中不同化合物对红细胞膜的破坏有差别，且本研究中样品刺激性范围有限，不能从整体上反映出溶血作用的范围;在实验过程中，样品所含色素影响吸光度的测定，有可能影响结果的准确性，且前处理过程时间较长影响到对红细胞的溶解性，这些问题都是将来需要进一步研究并解决的。

【参考文献】

[1]程树军，焦红.实验动物替代方法原理与应用[M].北京：科学出版社，2010：285-304.

[2]Eloisa NA，Rosaura de FP，Octuvio AFP，et al.A Reassessment of the In Vitro RBC Haemolysis Assay with Defibrinated Sheep Blood for the Determination of the Ocular Irritation Potential of Cosmetic Products：Comparison with the In Vivo Draize Rabbit Test[J].ATLA，2008，21（12）：275-284.

[3]Balls M， Riddell RJ， Worden AN.Animal and alternatives in Toxicity Testing. London： Academic Press， 1983.Balls M，Riddell RJ， Worden A N， Animal and alternatives in Toxicity Testing.London： Academic Press， 1983.

[4]Hayashi T， Itagaki H， Fukuda T， et al.Multivariate factorial analysis of data obtained in seven in vitro test systems for predicting eye irritancy. Toxicology in vitro.1994;8：215-220.

[5]張文改，杨杏芬.眼刺激实验的替代方法及应用策略研究进展[J].华南预防医学，2007，33（1）：27-31.

[6]张文改，杨杏芬.基于细胞的眼刺激性体外替代方法建立与化妆品限刺激性逐步检测策略的初步研究（硕士学位论文）[D].广州：中山大学，2007：15-18.