莫大超 李君久 彭亮 刘志远 王杰云 袁积汝

胃溃疡属于消化性溃疡的一种，是一类发生于胃部的粘膜损伤。作为一类发生于消化道的常见病和多发病，胃溃疡病程较长且较易反复发作，严重的影响了患者的生活质量［1-3］。既往的流行病学研究表明包含胃溃疡在内的消化性溃疡是一类遗传和环境共同作用的复杂疾病，遗传学因素可以解释其39%的发病风险［3］。既往研究表明包含幽门螺旋杆菌感染、吸烟、饮酒以及多个易感基因均对胃溃疡的发生和发展造成一定影响［4-6］。一项基于日本人群的大样本全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）提示位于PSCA基因上的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点rs2294008与消化性溃疡的疾病状态存在显著性的关联［7］。然而由于不同群体遗传背景的差异，这一研究结果在中国人群中的有效性尚待验证。本课题采用候选基因的遗传学关联研究策略，以中国汉族人群作为研究对象，对覆盖PSCA基因的若干SNP位点与胃溃疡的潜在关联进行研究，在中国人群中评估该基因相关SNP对胃溃疡发病风险的贡献情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料

研究对象主要包括胃溃疡病例组和健康对照组，所有个体均来自于东莞东华医院普外科就诊患者。两组受试者均为东莞及其周边地区汉族居民，且无血缘关系。所有受试者均接受胃镜检查，并在胃镜检查期间取出了两个活组织检查样本。胃溃疡患者纳入标准：①反复上腹部疼痛或不适，②胃镜提示胃溃疡病变，③胃镜病理活检提示良性病变。本研究对象的排除标准包括：①受试者服用过非甾体抗炎药、铋盐和抗生素，②罹患胃部肿瘤、增加胃酸分泌的疾病、肾衰竭，③存在器官移植的情况。本研究经伦理委员会批准，并获得每位受试个体的书面知情同意。受试者的基本临床数据通过询问病史获得（年龄、吸烟和饮酒情况）。胃溃疡组688例，其中男372例，女316例，平均年龄（46.4±13.5岁）；健康对照组1 442例，其中男783例，女659例，平均年龄（46.5±14.2岁）。

1.2 方法

1.2.1 幽门螺旋杆菌感染状态

利用快速尿素酶试验与组织病理学检查（吉姆萨染色和抗幽门螺杆菌IgG抗体检测）判断所有参与者的幽门螺杆菌感染状态。使用直接酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（130226，郑州博赛生物有限公司）在所有参与者的血清样品中检测抗幽门螺杆菌IgG抗体，操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.2 DNA的提取

依据DNA提取试剂盒（Genomic DNA kit，Axygen Scientific Inc.，CA，USA）中的说明书，从外周血白细胞中提取了基因组DNA，并将所提取的DNA储存在-80℃的环境下备用。

1.2.3 SNP选择与基因分型

利用千人基因组数据库中的北京汉族人群数据，选取PSCA基因内最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）≥0.02且杂合度≥0.2的SNPs位点，共计63个。对这63个SNPs以r2≥0.7为条件进行标签SNP的遴选，总计11个标签 SNPs（rs2978974，rs184389994，rs117340570，rs2978977，rs146194718，rs10956997，rs587606222，rs117919141，rs13262164，rs2294008，rs2976391）被纳入本研究的后续分析。本研究使用高通量Sequenom MassARRAY平台（Sequenom，San Diego，CA，USA）对选择的标签SNP进行基因分型，并使用Sequenom Typer 4.0软件处理结果。本研究中每个标签SNP的基因分型成功率均大于99%，整体基因分型成功率也大于99%。

1.2.4 统计学处理

分别统计病例组和对照组基因型分布频率，经Hardy-Weinberg平衡检验后，用Plink软件包进行分析［8］。应用χ2检验分析病例组和对照组基因型的分布差异，用比值比（OR）及95%CI表示相对危险度。部分SNP由于计数资料稀疏性采用Fisher精确检验。利用Haploveiw软件绘制了本次研究所纳入的候选SNP构成的连锁不平衡（LD）图谱［9］。采用Bonferroni法对多重检验结果进行校正，P＜0.005为差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 PSCA基因11个SNPs的基因型频率

本次研究所纳入11个PSCA基因的相关SNP位点全部位于非编码区。所选SNP的MAF均大于0.01，且在对照组中均处于哈迪温伯格平衡状态，见表1。

2.2 连锁不平衡图谱

11个SNP位点的连锁不平衡图谱显示这些位点间的关联关系较弱，最大的r2值为0.66存在于SNP rs587606222和rs117919141之间，见图1。

2.3 PSCA基因rs2294008多态性与胃溃疡易感性

遗传学关联结果显示PSCA基因SNP位点rs2294008的多态性与胃溃疡易感性存在显著性关联（OR=0.73，P=4.78×10-5，见表 2）。该 SNP的 T等位基因在对照组中的分布频率（26.2%）高于病例组（20.5%），差异具有统计学意义（P＜0.005）。T等位基因可能是胃溃疡的保护性因子。其他10个SNP的基因型和等位基因在病例组和对照组中的差异均无统计学意义（P＞0.005）。

2.4 性别、吸烟、饮酒状态以及幽门螺旋杆菌感染情况与PSCA基因rs2294008多态性和胃溃疡易感性的关系

对性别、吸烟、饮酒状态以及幽门螺旋杆菌感染情况这四种非遗传学因素的分层分析发现SNP rs2294008与胃溃疡的易感性在除抽烟之外不同因素的亚组中均差异有统计学意义，其OR值在不同的亚组中基本保持一致（详见表3）。抽烟的亚组内并未发现SNP rs2294008与胃溃疡的易感性，可能的原因是病例和对照的样本数过少导致的统计效力偏低所造成。

表1 11个所选SNP的基本信息及次等位基因频率和哈迪温伯格检验结果Table 1 Basic information including minor allele frequency and results of Hardy-Weinberg equilibrium tests for 11 selected SNPs

图1 PSCA基因11个SNPs的连锁不平衡图示Figure 1 Linkage disequilibrium plot made from 11 selected SNPs of gene PSCA

3 讨论

PSCA基因可以编码一类糖蛋白，这些糖蛋白可以由糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上［10-12］。既往研究表明PSCA基因在多种肿瘤细胞中的表达水平均较高，此外通过小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）对PSCA的表达进行干扰后，细胞的生长也会受到显著性的抑制［13-14］。这些研究提示PSCA基因所编码的蛋白对与细胞的增殖过程中扮演了重要的角色。在胃溃疡的发病过程中，表皮细胞的增殖情况起到了较大的作用［15-16］。此外，既往研究表明PSCA基因相关的多肽可以作为T细胞靶向位点对前列腺癌进行免疫治疗，而在细胞基质中存在的PSCA蛋白往往要比依附于细胞表面的PSCA蛋白更容易的被水解［14］。由于SNP rs2294008的C等位基因在被研究中被发现是胃溃疡的风险等位基因，因此我们推测其可能会通过加速PSCA蛋白的水解过程并通过CD4+或CD8+T细胞的激活诱发下游的一系列免疫反应来提高包括胃溃疡在内的消化道溃疡的发病风险。关于PSCA基因在胃溃疡发病和发展过程中的作用，还需后续基于动物模型或细胞层面的深入研究。

本研究在我国广东地区汉族人群中发现rs2294008位点的基因型频率以及等位基因频率均在胃溃疡病例组和对照组间的分布存在着显著性的差异，该位点的T等位基因在胃溃疡病例中的分布频率显著性的高于对照组。针对PSCA基因多态性与消化道溃疡的遗传学关联研究既往开展较少，目前仅见较早前发表的基于日本人群的针对十二指肠溃疡的研究一项［3］。在该研究中，学者发现rs2294008的T等位基因对十二指肠溃疡具有显著性的保护作用，其OR值为0.67，这与本次研究获得的关联信号结果基本一致。此次研究结果提示广东地区汉族人群胃溃疡的的遗传风险可能与PSCA基因rs2294008位点的基因型有关，后续研究可以通过检查该位点的变异情况从遗传流行病学的角度对胃溃疡的易感人群进行筛查。在后续的针对性别、吸烟、饮酒状态以及幽门螺旋杆菌感染情况这四种非遗传因素的分层分析中发现在不同的分层中SNP位点rs2294008对胃溃疡的发病风险贡献情况基本一致，这提示PSCA基因SNP位点rs2294008的遗传学作用可能是独立于这些已知的危险因素而存在的。

表2 基于单个位点的关联分析结果Table 2 results of single marker based genetic association analyses for 11 selected SNPs

表3 rs2294008位点遗传学关联效应分层分析Table 3 Stratification analyses for SNP rs2294008

本次研究所使用的DNA多态性位点为单核苷酸多态性位点，该位点为第3代遗传标记，具有覆盖度高、密度大和分型成本低的特点，可以基本满足遗传学关联分析的需要［17］。此外本次研究使用了Sequenom MassARRAY平台对所选SNP进行基因分型，该平台主要基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MAL-DI-TOF-MS）技术，是目前最为常用的SNP检测技术，具有高通量以及高准确度的特点，完全可以适合于本次研究的大规模筛查需要［18］。

群体分层是遗传学关联研究的主要混杂因素，这一混杂因素如果不能得到有效控制，会显著地提升遗传学关联信号的假阳性率［19］。本研究作为一项基于候选基因的遗传学关联研究，分型的SNP位点数目有限，因此无法使用目前常见的统计学手段对潜在的群体分层进行校正。然而在样本纳入过程中，通过对受试者来源地进行限制，可以部分的对受试者的遗传背景的遗传异质性进行控制，从而部分的消除了群体分层这一混杂因素的干扰。本次研究中由于研究经费和人力的限制采用了候选基因的研究策略，选取了11个遗传多态性位点进行研究，这11个位点所包含的信息并不能够覆盖整个PSCA基因区域，因此在进行研究的过程中可能遗漏了某些较为重要的遗传学位点。在未来的研究中通过选取更高密度的遗传学变异位点对PSCA基因与胃溃疡的遗传学关联进行更加系统性的研究，或许可以弥补这一缺憾。此外，由于目前PSCA基因rs2294008位点与胃溃疡易感性的作用机制尚未明确，因此有关该SNP位点的基于细胞或动物模型的功能分析尚待开展，以期获得更有说服力的结果。