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单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

2019-11-28王立霞孟庆玲乔军郭晶伍晔晖才学鹏蔡扩军王登峰

江苏农业科学 2019年18期
关键词:原核表达克隆

王立霞 孟庆玲 乔军 郭晶 伍晔晖 才学鹏 蔡扩军 王登峰

摘要:应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549 与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。

关键词:单核细胞增生李斯特菌;内化素Lmo0549;克隆;分子特征;原核表达

中图分类号:S852.61 文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2019)18-0199-05

收稿日期:2018-05-21

基金项目:国家自然科学基金(编号:31360596、30960274);国家重点研发计划(编号:2016YFD0500900);乌鲁木齐市科技局渝乌科技合作项目(编号:Y161220001);新疆生产建设兵团中青年科技创新领军人才计划(编号:2016BC001)。

作者简介:王立霞(1992—),女,甘肃陇西人,硕士,研究方向为病原分子生物学。E-mail:645432907@qq.com。

通信作者:乔 军,博士,教授,研究方向为畜禽病原分子生物学。E-mail:qj710625@163.com。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称LM)是一种兼性厌氧的胞内寄生革兰氏阳性人畜共患病原菌[1]。该菌在自然界中广泛存在,可在高盐和酸性环境下存活[2],易污染肉类、蛋类、奶制品等动物源性食物,对食品卫生安全造成严重的威胁[3]。同时,LM可以突破宿主血脑屏障和血胎屏障,临床上引起动物脑膜脑炎和流产等症状[4-5],对畜牧业造成较大危害。因此,世界卫生组织(WHO)把LM列为四大食源性致病菌之一[6-7]。

LM作为一种细胞内寄生的致病菌,可以感染专职和非专职吞噬细胞,并在胞内长期生存。在LM侵染宿主细胞时,许多毒力蛋白发挥了重要的作用[8]。现有研究证实,内化素家族(internalins)是与LM侵染和致病力密切相关的一类蛋白,位于LM表面[9],在LM侵入宿主细胞时发挥着重要的作用[10]。目前,在LM基因组中已经发现的内化素约有20余种,其中在介导LM穿越宿主血脑屏障、血胎屏障的过程中起重要作用的内化素有InlA和InlB[11-14]。Faralla等发现,新型毒力因子InlP可介导对胎盘的亲嗜性[15];Popowska等研究发现,InlL是一种新型的黏附素,既可参与生物膜的形成,也可与构成黏液层的主要分泌黏蛋白结合,发挥黏附作用[16]。然而,目前许多内化素的生物学功能仍不清楚,因此深入开展LM毒力因子-内化素生物学功能研究,对于揭示LM感染的分子机制具有重要的科学价值。

Lmo0549是近年来发现的一个含有WxL结构域的新型内化素,而WxL蛋白属于表面蛋白Csc家族。在LM表面蛋白Csc家族中,只有Lmo0549含有N端LRR区,至今其生物学功能和作用机制尚不清楚。本试验对lmo0549基因进行克隆、序列分析和氨基端抗原表位较强的区域进行表达研究,为进一步探讨LM在侵入宿主细胞中的分子作用机制奠定前期基础。

1 材料与方法

1.1 主要菌株与试剂

单核细胞增生李斯特菌野毒株LM-SB5、大肠杆菌(Escherichia. coli) DH5α、大肠杆菌 BL21(DE3)均由笔者所在的实验室保存;pMD19-T载体、T4连接酶、DNA Marker、蛋白Marker均购自TaKaRa公司。

1.2 引物設计与合成

根据GenBank登录的lmo0549基因序列(登录号为984412),运用Primer 5.0设计1对特异性引物:lmo0549-F,5′-ATGAAATTTAATTGGAAAGTAGTTCTGCTG-3′;lmo0549-R,5′-TTATGGTCGAGGCGCATCCTC-3′。同时,设计扩增lmo0549氨基端抗原集中区(1~159位氨基酸)的上、下游特异性引物:lmo0549C-F,5′-CGGAATTCATGAAATTTAATTGGAAAGTAGT-3′;lmo0549C-R,5′-CCTCGAGTCCATTTGGTGCCTTTAA-3′。在lmo0549C-F和lmo0549C-R引物的5′端分别加酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ(下划线)及保护性碱基(斜体),将设计好的引物发至北京华大基因生物公司合成。

1.3 lmo0549基因的扩增、克隆及其编码蛋白分子特征分析

以LM-SB5菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增lmo0549基因,反应体系如下:水9.0 μL,PCR Mixture8.0 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2.0 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 50 s,51 ℃ 50 s,72 ℃ 2 min,33个循环;72 ℃ 10 min。将回收纯化的目的片段克隆至pMD19-T载体后送至华大基因生物技术公司测序,并将测序正确的质粒命为pMD19-T-lmo0549。利用在线软件protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析内化素lmo0549基因的氨基酸组成及其编码蛋白的理论分子质量;应用motif(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)在线软件分析该基因的糖基化位点;应用predictprotein(http://www.predictprotein.org/)和expasy(http://www.swissmodel.expasy.org/)分析其二级结构和三级结构;采用smart(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/)预测其蛋白结构域;利用DNAstar软件分析其抗原表位;在NCBI中检索富含亮氨酸重复基序、WxL结构域和表面蛋白的粪肠球菌、植物乳杆菌和不同李斯特菌株的氨基酸序列,应用MEGA 5.0构建系统进化树(NJ法,1 000次重复)。

1.4 lmo0549基因编码蛋白氨基端抗原集中区的扩增

应用卢海亭等的方法[17]构建重组质粒pMD19-T-lmo0549C。

1.5 重组蛋白Lmo0549C的诱导表达与鉴定

用EcoRⅠ/XhoⅠ对pMD19-T-lmo0549C和pET-32a(+)进行同步双酶切,分别回收目的片段和载体,采用T4连接酶连接,构建原核表达载体pET-32a(+)-lmo0549C,运用PCR及双酶切鉴定,鉴定正确的重组表达载体并命名为pET-32a(+)-lmo0549C。将pET-32a(+)-lmo0549C重组表达质粒转化至大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞。用15% SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况,同时运用蛋白质印迹法分析其反应原性。

2 结果与分析

2.1 lmo0549基因的扩增与克隆

经琼脂糖凝胶电泳分析,扩增获得的目的条带与预期值2 034 bp相符(图1)。对阳性克隆pMD19-T-lmo0549进行PCR筛选和鉴定,并进行测序分析,表明目的基因已成功克隆至T载体。

2.2 lmo0549基因测序结果及分子特征分析

Lmo0549蛋白基因全长2 034 bp,编码677个氨基酸。SMART软件分析结果(图2)表明,Lmo0549蛋白氨基酸序列中从N端到C端包含5个富含亮氨酸的重复基序(LRR,134~181、182~211、212~232、233~277、278~292位氨基酸),1段PKD重复序列(360~452)和1个WxL结构域(541~675)。SingalP分析结果显示,该蛋白氨基酸序列第1个至第23个氨基酸残基构成信号肽;TMHMM分析表明,Lmo0549蛋白第7~26位氨基酸为跨膜区,第134~675位共541个氨基酸为成熟肽蛋白,其中亮氨酸占9.3%。Motif Scan分析结果(图3)表明,成熟蛋白上含有潜在的N-联糖基化位点10个、依赖于cAMP-cGMP蛋白激酶磷酸化位点2个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。二级结构和3D结构分析结果(图4)显示,Lmo0549蛋白主要由无规卷曲和延伸链连接α-螺旋和β-转角形成中空状的靴状结构,其中靴筒部分是与宿主细胞作用的入侵相关结构域集中区。DNAstar分析表明,Lmo0549蛋白B细胞抗原表位主要集中在24~123、144~185、193~271、296~363、403~423、465~492、535~583、593~613、621~676位氨基酸序列。

2.3 Lmo0549蛋白氨基酸序列同源性及遗传进化分析

lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与GenBank中LM EGD-e的假定蛋白(登錄号为NP_464077.1)同源性为8804%。BLAST分析显示,Lmo0549蛋白在LM中具有较高的保守性,在LM中氨基酸同源率为88%~100%。遗传进化分析结果(图5)表明,Lmo0549蛋白与LM富含亮氨酸重复结构域蛋白(登录号为WP_003727281.1)位于同一遗传分支,同源性达到99.56%,亲缘关系最近,表明该蛋白富含亮氨酸的重复基序。Lmo0549蛋白与LM Lmo0549家族含有WxL结构域的2类内化素(登录号为WP_047932789.1)的同源性为87.74%,表明该蛋白属于Lmo0549家族含有WxL结构域的2类内化素。Lmo0549蛋白与粪肠球菌和植物乳杆菌的亲缘关系相对较远。

2.4 lmo0549基因氨基端抗原集中区的扩增结果

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析得到与预期值477 bp 相符的单一条带。对pMD19-T-lmo0549C重组质粒双酶切,由1%琼脂糖凝胶电泳鉴定获得与目标值相符的2 692、477 bp 2条带,表明已成功克隆获得了lmo0549C(图6)。

2.5 pET-32a(+)-lmo0549C重组表达载体鉴定及诱导表达

重组质粒经双酶切鉴定,可得到大小约477 bp的目的片段和5 900 bp的pET-32a(+)载体片段,与预期一致(图7),表明重组载体pET-32a(+)-lmo0549C已构建成功。pET-32a(+)-lmo0549C转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明融合蛋白Lmo0549C大小为33.8 ku,且表达量较高。将菌体超声破碎离心后分析显示,重组蛋白Lmo0549C主要以包涵体的形式存在;蛋白质印迹法分析结果表明,表达重组蛋白与兔抗单增李斯特菌阳性血清发生反应可出现单一的反应条带(图8),表明重组蛋白Lmo0549C已成功表达,且具有一定的反应原性。

3 讨论与结论

LM是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性病原菌,在入侵宿主细胞的过程中,包括毒力因子、黏附分子、内化素等众多蛋白分子,构成了一系列复杂的过程[18]。内化素家族(internalins)是由LM毒力相關基因编码的一组蛋白,位于LM菌体的表面[9,19-20], 现有研究证实,LM的内化素家族共有25~27个成员,其中以富含亮氨酸的重复结构串联排列在氨基末端区域为特征的InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlH和InlJ,具有相似的结构,在入侵宿主细胞过程中发挥着重要作用。

根据内化素的分子结构特征,LM内化素可分为3类[18]:第1类可直接与蛋白共价结合到细胞壁肽聚糖上,具有LPXTG结构,共有21个成员;第2类能够促进细胞壁磷脂酸的解旋,具有以二肽(GW)为重复转录起始位点的内化素,共有2个成员;第3类为缺少结合位点的分泌蛋白,InlC是其中的一员[21]。近年来,一些新的LM内化素被发现。Stachowiak等发现,内化素蛋白Lmo0171具有双重功能,既可介导黏附和内化作用,也可影响细胞骨架的重排[22]。姚浩等发现,内化素LM NTSN 0282与其入侵肠上皮细胞相关[23]。王少辉等证实,InlK在LM的侵袭、体内定殖和存活能力方面发挥着重要的作用[4]。

遗传进化树分析显示,Lmo0549蛋白在LM中有较高的序列保守性,属于含有WxL结构域的第2类内化素,在其羧基端具有指导非共价结合至细胞表面的WxL结构域。研究表明,含有WxL结构域的WxL蛋白在细菌表面形成多组分复合物[24]。WxL蛋白属于近年来发现的表面蛋白Csc家族,LM基因组包含2个Csc样基因簇:lmo0549、lmo0550、lmo0551和lmo0552基因形成第1簇,而lmo0585、lmo0586和lmo0587构成第2簇,其中4种基因产物具有C端WxL结构域,但只有Lmo0549含有N端LRR区。Brinster等已经证明,粪肠球菌WxL蛋白EF2686可通过WxL结构域与肽聚糖结合而存在于细菌的表面[25],推测Lmo0549通过类似的机制附着于细菌表面。

本研究对lmo0549编码的氨基酸序列分析表明,在其N端存在5个LRR基序,但在其后面还存在1段PKD重复序列,其中PKD重复序列与细胞黏附有关[11],因此推测Lmo0549可能参与细菌对宿主细胞的侵染过程。本研究通过对lmo0549进行克隆、表达和分子特征分析,为深入研究其功能以及它们与毒力因子、侵入宿主细胞之间的相互关系,进而揭示Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子机制打下了前期基础。

参考文献:

[1]Farber J M,Peterkin P I. Listeria monocytogenes,a food-borne pathogen[J]. Microbiological Reviews,1991,55(3):476-511.

[2]彭叶龙. 单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建及部分生物学特性研究[D]. 石河子:石河子大学,2015.

[3]王 旭,孙晓红,潘迎捷,等. 单增李斯特菌WaX12及其sigB缺失突变株在不同pH下生长动力学的比较[J]. 食品与生物技术学报,2016,35(5):477-484.

[4]王少辉,刘萍萍,魏建超,等. 单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析[J]. 中国动物传染病学报,2017,25(4):19-23.

[5]刘武康,陈国薇,吴 嫚,等. inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响[J]. 食品科学,2016,37(23):166-172.

[6]丁 剑. 基于srtA的Lm细胞壁差异蛋白的筛选及lmo2714基因缺失株的构建[D]. 石河子:石河子大学,2017.

[7]Good J A,Andersson C,Hansen S,et al. Attenuating listeria monocytogenes virulence by targeting the regulatory protein PrfA[J]. Cell chemical biology,2016,23(3):404-414.

[8]杨丽红. SigmaB基因缺失对单核细胞增生李斯特菌致病性和环境应激能力的影响[D]. 石河子:石河子大学,2013.

[9]谢 堃. Rli87基因缺失对LM环境应激及致病力的影响[D]. 石河子:石河子大学,2015.

[10]谢小冬. 单核细胞增生李斯特氏菌内化素A分段表达及主要功能区的确定[D]. 哈尔滨:东北农业大学,2014.

[11]Bierne H,Sabet C,Personnic N,et al. Internalins:a complex family of leucine-rich repeat-containing proteins in Listeria monocytogenes[J]. Microbes and Infection,2007,9(10):1156-1166.

[12]Braun L,Dramsi S,Dehoux P,et al. InIB:an invasion protein of Listeria monocytogenes with a novel type of surface association[J]. Molecular Microbiology,1997,25(2):285-294.

[13]Cabanes D,Dehoux P,Dussurget O,et al. Surface proteins and the pathogenic potential of Listeriamonocytogenes[J].Trends in Microbiology,2002,10(5):238-245.

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