王宁宁 王伟杰 王玉康 曹维 李明 Sundus Zafar 胡茂龙 浦惠明 谭小力

摘要：农杆菌介导的浸花法（floral-dip）是一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养的遗传转化法，在拟南芥中已得到了广泛的应用，但由于诸多因素的影响，其在油菜中的转化效率受到了很大的制约。以甘蓝型油菜为研究对象，通过对雌蕊柱头开裂时间的研究，发现即将开放的10～15个花苞的柱头是裂开的，此时最有利于农杆菌进入子房室完成转化。对这部分花蕾进行浸花法转化，得到的T1代种子发芽后通过除草剂筛选获得抗性转基因植株，进一步对这些植株进行PCR验证，其阳性率高达72.7%。该研究能进一步提高农杆菌转化效率，实现甘蓝型油菜更有效的遗传转化。

关键词：甘蓝型油菜;浸花法;柱头开口;转化效率;农杆菌

中图分类号： S634.301文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0114-03

收稿日期：2018-06-30

基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0100305）。

作者简介：王宁宁（1991—），男，山东济南人，硕士研究生，研究方向为甘蓝型油菜功能基因组学。E-mail：wnn517tdx@163.com。

通信作者：谭小力，博士，研究员，研究方向为植物细胞中油脂合成代谢调控的关键因子和网络调控、多倍体植物功能基因组研究策略的建立、外源基因在植物中高水平表达及合成生物学平台的构建。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是四大油料作物之一，位居全球五大经济作物之列，是食用植物油和蛋白的重要来源。在油菜的遗传转化研究中，科研人员越来越青睐应用基因工程改良油菜品种，随着转基因技术的发展，用于外源基因的遗传转化方法越来越多，大体可分成2类：一类是农杆菌介导的遗传转化法;另一类是外源基因直接导入法，如基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法、电击法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉管通道法等[1-5]。其中农杆菌介导法在油菜的遗传转化中运用得最多。1985年，Horsch首次利用根癌农杆菌介导法获得转基因甘蓝型油菜[6]。农杆菌介导的浸花法转化是由真空渗透（vacuum infiltration in planta）转化法[7-8]简化而来的[9-10]，只需将植株的花序浸泡在农杆菌转化液中几分钟，然后等种子成熟后即可通过筛选得到转基因的种子[11]。付绍红等在对甘蓝型油菜进行浸花法转化后，通过GUS（-葡萄糖苷酸酶）和GFP（绿色荧光蛋白）报告基因的瞬时表达检测发现，在转化植株未受伤的叶片表面、子房表皮、蜜腺、柱头均检测到GUS活性或GFP蛋白表达[12]。这说明农杆菌有可能通过以上部位进入受体植株细胞完成转化过程。之前的研究表明，农杆菌介导的浸花法转化主要侵染的是雌蕊而不是雄蕊，雌蕊中的胚珠是转化的靶细胞[13]。之前的研究发现，拟南芥的子房室不总是关闭，卵细胞发育突出，会延伸成瓶状结构并在顶部开口，花发育后期子房室顶部闭合。转化一般在花开放前5～10 d进行，此时雌蕊开放，农杆菌得以进入子房并将T-DNA转移到卵细胞[14]。油菜的发育与拟南芥类似，胚珠在最初发育阶段，先形成1个细胞环，进而形成1个顶端开口的瓶狀结构，结构的顶端约在开花前3 d形成柱头，随后顶端开口闭合，在此之前转化都有可能发生[15]。花开放后短时间内即完成授粉受精过程且柱头顶端已经闭合，此时的雌蕊已不适合进行转化。因此，利用农杆菌介导的浸花法进行转化时往往选择未开放的花蕾。本研究中，笔者通过对未开放花的雌蕊柱头开裂时间的研究，探究了农杆菌进入雌蕊子房室的最佳时间，从而能进一步提高农杆菌转化效率，实现甘蓝型油菜更有效的遗传转化。

1 材料与方法

1.1 材料

以甘蓝型油菜中双11为研究材料，材料由笔者所在实验室提供。含有携带Bar基因的质粒的农杆菌，菌种由笔者所在实验室提供。试验时间：2018年4月;试验地点：江苏大学生命科学研究院油菜试验田。

1.2 方法

1.2.1 雌蕊的固定及观察

取正常生长的油菜开花期待开放的花蕾，从靠近已开放花朵的第1个花蕾开始，由下至顶端依次取样并编号，将未开放的第1个花蕾命名为01号，第2个花蕾命名为02号，依次往上取样（对应的雄蕊编号分别为C01、C02……）。将花萼、花瓣及雄蕊去除，测量雌蕊长度并记录，然后将雌蕊置于福尔马林-醋酸-乙醇（FAA）固定液中[16]，于4 ℃固定24 h。固定好后用扫描电镜观察柱头开口时间的差异情况。

1.2.2 农杆菌介导的浸花法转化油菜

将含有携带Bar基因的质粒的农杆菌通过浸花法转化甘蓝型油菜中双11。浸花前将已开放的花剪掉，保留10～15个待开放的花蕾用于浸花，将其余幼嫩的花蕾剪掉。将携带转化载体的农杆菌接种于250 mL LB培养基中摇菌培养至D600 nm为0.8～1.0左右，离心后用250 mL MS液体培养基重悬，并加入乙酰丁香酮、6- 苄氨基腺嘌呤（6-BA）及SilwetL-77。将花蕾浸入农杆菌悬浮液中浸泡5 min，浸花完成后套上羊皮纸带，花期结束后摘掉纸袋。待种子成熟后收获、储存[17]。

1.2.3 阳性转化株的筛选

用于转化的载体上携带有1个抗除草剂的筛选标记基因Bar，如图1所示，因而可以利用除草剂进行转基因植株的筛选。将浸花后收获的T1代油菜种子播种于托盘中，待幼苗长出1张真叶时通过喷洒除草剂筛选出阳性的转化株[18]。提取除草剂筛选后存活下来的油菜幼苗叶片基因组进行PCR验证，PCR扩增片段位置如图1所示，PCR扩增的引物序列如下：

Bar-F：5′-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAA-3′;

Bar-R：5′-CTGCACCATCGTCAACCACTA-3′。

2 结果与分析

2.1 柱头开裂情况观察

利用扫描电镜对FAA固定的甘蓝型油菜雌蕊柱头进行观察，发现并不是所有未开放花蕾的雌蕊柱头都是开口的，如图2所示，在所有扫描的雌蕊柱头中，只有编号靠前的10个左右的柱头是开口的，即最接近开放的10朵左右的花蕾柱头是开口的，这一部分花蕾在进行农杆菌浸花时，农杆菌最有可能通过柱头上的开口进入子房内部，进而完成转化。

如图3所示，通过对雌蕊长度的测量，可以发现柱头开口的这一部分（C01～C12）雌蕊较其他雌蕊长度略长，发育较早，距离开花的时间也相对较短，便于进行转化。

2.2 阳性转化株的筛选

对浸花法转化得到的油菜种子萌发后的幼苗喷洒除草剂处理，部分油菜幼苗存活了下来，如图4所示。由于进行转化的载体上含有除草剂抗性基因Bar，其转基因植株对除草剂具有一定程度的抗性。因此这部分存活下来的油菜幼苗很有可能是转化成功的转基因植株。

2.3 阳性转化株的分子鉴定

提取存活油菜幼苗的叶片基因组，PCR扩增Bar基因（图1）中444 bp的片段，由此来进一步验证存活的幼苗是否为转基因植株。如图5所示，存活植株中有很大一部分都扩增出了与质粒对照相同大小的条带，说明这部分植株确实为转基因植株，存活植株的阳性率约为72.7%。以上结果表明，对柱头开口时间的正确把握，对于提高油菜遗传转化效率具有重要作用。

3 讨论

随着甘蓝型油菜研究的不断深入，建立一种高效、便捷的油菜遗传转化体系是非常有必要的。农杆菌介导的浸花法是一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养的遗传转化法，对于甘蓝型油菜的研究具有重要意义，已经应用到了油菜的遗传转化中[19-22]，但在实际应用中存在的各种因素导致油菜转化效率非常低。本试验通过扫描电镜，对油菜雌蕊柱头的开口时间进行了观察，发现并不是所有未开放花蕾的雌蕊柱头都是开口的，只有最接近开放的10～15个的花蕾柱头是开口的。这一部分花蕾在进行农杆菌浸染时，由于雌蕊顶端有开口，便于农杆菌进入子房内部，进而完成转化。对浸花法获得的油菜种子萌发后的幼苗进行除草剂筛选及PCR鉴定，发现存活下来的油菜幼苗为转基因植株的比例达到72.7%，这一结果也证实了该方法的可靠性，即通过正确把握油菜雌蕊的开口时间，选择最恰当的油菜花蕾进行浸花转化，将会大大提高油菜的遗传转化效率，对甘蓝型油菜的研究具有重要意义。

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