文│吴日钧（江苏省海安市曲塘镇畜牧兽医站）

按照《农业农村部关于加强屠宰环节非洲猪瘟检测工作的通知》（农牧发[2019]7号）和农业农村部119号公告要求，即使是年屠宰量5万头以下的屠宰场（企业）也不得迟于2019年7月1日前全部实现非洲猪瘟自检；驻场官方兽医必须要监督生猪屠宰场（企业）按照 “批批检，全覆盖” 的原则全面开展非洲猪瘟检测，不得遗漏任何一批次生猪的检测。

屠宰环节是连接生猪产销的关键环节，在屠宰环节实施非洲猪瘟自检制度，而不是在生猪产地养殖场户实施，能以最小人力、经济成本来取得最大控制、切断病毒传播途径的效果；而在屠宰场，容易采集样品，容易结合临床和剖检情况判断，能够及时发现并且开展追溯，及时消除隐患；还能够严防染疫生猪产品进入食品加工流通环节，消除消费者对食用猪肉的担忧，扶持养猪户的积极性，保护生猪健康发展。

屠宰场（企业）开展非洲猪瘟自检，对屠宰场（企业）实验室环境、技术人员、仪器设备和检测试剂都有着高标准要求。要建设符合标准的病毒核酸（荧光PCR）检测实验室，并配备非洲猪瘟荧光PCR检测技术人员，按程序步骤规范操作处理。当前，学习提高非洲猪瘟的检测技术成为屠宰场（企业）检测、复核、监督等人员的必修课。

为做好屠宰环节非洲猪瘟病毒检测（荧光PCR）工作，参考《非洲猪瘟诊断技术》（GB/T 18648-2002），笔者有以下几点思考：

一、确保样品来源规范采集

在确保全覆盖的前提下， 可以进行入场前检测，即在生猪进场前，以车为单位，采集全部生猪血液样品，均匀混合后进行检测。每车生猪采集血液后检测时抽取血液体积数量要一致；有的地方实行每份混合血液来源的生猪数量要控制在50头以下，即生猪数量每50头或者不足50头时，做1份混合血液的非洲猪瘟检测。具体混样生猪数量可根据所使用的检测试剂盒的技术指标科学确定。采集时，最好选择瘦弱的生猪作为采集对象，以便更好发现 “问题猪”，发现后尽早按规定处理。

农业农村部已经对生猪屠宰环节非洲猪瘟检测有关要求进行了补充，即按照农牧便函[2019]606号要求，生猪屠宰场（企业）要按照 “头头采、批批检、全覆盖” 的原则，对每一头待宰生猪都要采集其血液样品；若选择在生猪进入屠宰场（企业）前进行采样的，也必须对每一头拟进厂（场）生猪进行采血，做到抽样全覆盖。若同批猪中有病死猪，应优先采集病死猪的脾脏、淋巴结等组织病料开展实验室检测。将采好猪血的注射器或者采血管在室温下倾斜静置2～4小时（防止暴晒），或者置于37℃温箱内1小时，待大部分血清析出后，取出血清，必要时离心分离血清（最低建议量为5毫升）。

样品的采集、运输与保存应当符合农业农村部公布的《非洲猪瘟疫情应急实施方案（2019版）》的要求。

二、确保诊断试剂可靠和操作规范科学

严格非洲猪瘟病毒诊断试剂质量和检测操作程序。要考虑试剂是否可靠稳定，操作是否规范科学。

要使用经过农业农村部批准或者经过中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法和检测试剂盒。要强化检测技术保障，细化检测标准和查找程序。要按照农业农村部154号公告中的检验试行规程、质量标准等执行。

阳性对照的Ct值＜30且出现特异性扩增曲线；阴性对照应无Ct值或者Ct值≥40且无特异性扩增曲线，线形为直线或者轻微斜线，无指数增长期。试验结果才有效；否则应该重新进行试验。

被检样品Ct值应＜40且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无Ct值或者Ct值≥40，判为阴性。

PCR检测的每一步都应在专门区域或者地点进行；使用前应该将荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全融化，充分振荡混匀，瞬时离心，尽量吸取液体上层；试剂盒不同组分间不得交叉，样品、阳性对照等在使用后及时封盖，避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性；样品、冻存试剂要避免反复冻融。

凡每一个步骤要吸取转移样品时均应该更换一个移液器吸头（枪头）。

在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得最佳的效果；特别用移液器吸取几微升的液体时，吸取时要足量，转移注入时要彻底注入，因为本来转移的液体就是微量，不能有一点点出入。

检测过程中应该使用不带荧光物质的一次性乳胶手套。

三、保证检测数据真实可靠

每次检测时， 必须要设立阴性对照和阳性对照，不可为降低检测成本而省略此步骤；对检测中的阴性对照和阳性对照阈值数据，要定期比对、校对；确定检测仪器、荧光PCR仪（包括配备的便携式电脑）、器材等是否需要维护保养。要保证检测结果的真实可靠、准确科学，必须如实记录检测结果。

四、检测台账是否完整

要完整详细原始保留检测报告和台账，不得涂改，中间各项不得漏缺。

五、加强屠宰场实验室内部管理

屠宰场（企业）的实验室建设可以参考河南省非洲猪瘟疫情防控工作应急指挥部制定的《生猪养殖屠宰及加工环节非洲猪瘟病毒核酸检测实验室建设技术指南》中的标准要求，屠宰场（企业）实验室分设挂、贴有明确标识的更衣室、样品处理室、试剂配置区、核酸提取区、扩增分析区、无害化处理室，并配备适用的消防等应急器材。屠宰场实验室制定并严格落实生物安全管理、安全防护、感染控制和生物安全应急预案等规章制度。

实验室要进行消毒效果的评估，使其严格消毒程序，强化消毒工作，达到有效消毒目的。屠宰企业建设符合PCR检测技术要求的实验室，检测试剂供应单位对屠宰企业检测技术人员进行培训，并跟踪服务。要定期对实验室的操作环境条件进行评估。

六、做好废弃物无害化处理

要做好检测后的样品（血液）及实验产生的废弃物（如：一次性采血盛血器、一次性使用真空采血管、一次性PE手套、耗材、器械）的及时收集，并进行无害化处置和消毒灭菌处理工作；感染性废弃物应该高压灭菌之后再转移至指定地点处理。严格做好清洁消毒工作。屠宰场（企业）和个人不得留存阳性样品，不得将阳性样品转送或者转卖给其他单位和个人。

七、完善相应检测技术支持

非洲猪瘟荧光PCR检测技术对操作人员的素质能力和对PCR原理的知识储备是有要求的。否则，在操作和读取数据时都容易出现纰漏。同时，荧光PCR检测技术还存在如下的现实问题：检测环节多，质量控制点多；操作相对复杂，反应时间较长；试剂组分多，需要自行配制；分区进行，环境控制要求严格等。检测的结果有可能因为血液样品保存不当或溶血、试剂回温失误等原因而受到影响。

因此，屠宰场（企业）做好非洲猪瘟检测工作，不但要有符合标准的荧光PCR检测实验室和规章制度，还要有懂得PCR原理和操作的技术人员。同时，采样、检测、复核、监督等人员要具备责任心和实事求是的态度，要有担当精神；并要坚持日常清洗消毒制度。