董哲,闫晓娟,杜会枝

(山西大学 分子科学研究所,山西 太原 030006)

0 引 言

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种以学习、认知和记忆障碍等为特征的神经退行性疾病。AD的胆碱能缺失学说认为:乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)的合成、释放及摄取减少或降解过多,造成ACh水平降低,进而导致AD病人学习能力下降和记忆力衰退[1]。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是中枢神经系统中水解ACh的一个主要功能酶,解剖学研究发现,AD患者脑部的AChE蛋白表达水平升高[2-3]。近年来乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究越来越多[4],目前美国食品药品管理局(FDA)批准上市的治疗AD的药物主要是AChE抑制剂,包括多奈哌齐、利凡斯的明和他克林等[5],但它们也有很明显的副作用和毒性,且生物利用率低。因此,寻找新型、效率高且低毒的AChE抑制剂是研究热点之一。

天然中草药多种多样,资源丰富,治疗疾病时表现出毒副作用小,所以,得到越来越多研究人员的关注[6-7]。连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl),木犀科连翘属植物,其果实是一种传统中草药,也是山西道地中药材之一[8]。据药典记载,连翘有清热解毒和消肿散结等功效[9]。现代药理学研究表明,连翘具有抗炎、抗氧化、抗菌等药理功效[10]。夏秋交际之时,果实刚熟还带有绿色时采摘,除去杂质,将其蒸熟,晾干得到的果实即为青翘(GreenForsythiasuspensa)。目前已经从动物实验研究发现连翘主要成分之一——连翘酯苷A对AD动物模型的学习记忆有改善作用[11-16],但尚未阐明连翘及其主要成分是否可以影响胆碱能系统发挥神经保护效应。本文采用Ellman法[17-18]对青翘中的AChE抑酶活性成分进行了筛选,并用敲除法进行了验证。

1 材料与方法

1.1 试剂药品

青翘,2016年7月份采摘于山西省长治市屯留县,经山西大学张立伟教授鉴定为木犀科连翘属连翘果实,样本编号为 20160702,自然阴干,用粉碎机磨成细粉,过60目筛,室温下密封避光保存。

AChE(E.C. 3.1.1.7,来源于电鳗鱼,编号:A832424,200 U/g)购于麦克林;碘化硫代乙酰胆碱(S-Acetylthiocholine iodide,Asch,编号:A602737)和5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB,编号:A620113)购于生工(上海);连翘酯苷A(编号:A0590)、芦丁(编号:A0103H)、连翘脂素(编号:A1144)和连翘苷(编号:A0272)购于成都曼思特(纯度均大于98%);色谱醋酸(编号:A35-500)和色谱甲醇(编号:A456-212)购于Fisher Scientific(上海);无水甲醇(编号:2334)购于天津市大茂化学试剂厂;D101大孔树脂购于天津制胶厂。其他试剂药品均为国产分析纯。

1.2 青翘的提取与分离

青翘粉末200 g,70%甲醇(V/V)为溶剂,以料液比1∶10,回流提取2次,每次2 h。用纱布粗滤,合并2次滤液。真空抽滤,滤液用旋转蒸发仪进行减压浓缩,得到青翘粗提物。

1.3 不同乙醇浓度洗脱物制备

将青翘粗提物按照水,20%、40%、60%、80%和95%乙醇(V/V)的顺序过D101大孔树脂,梯度洗脱,将不同梯度洗脱物分别合并浓缩,冷冻干燥,得固体粉末,依次标记为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6。

1.4 AChE酶活测定

不同乙醇浓度洗脱物溶于DMSO中,配制样品液。

在96孔板中利用Ellman方法[14-15]测定AChE酶活。一个EP管中依次加入275 μL PBS(pH=8.0),5 μL酶液(终浓度0.07 U/mL),10 μL样品溶液和10 μL的DTNB(终浓度1 mmol/L),混合均匀。96孔板中每孔加入100 μL混合溶液,37 ℃ 孵育15 min后,加10 μL Asch(终浓度3 mmol/L),37 ℃ 继续孵育25 min后,加入50 μL 4% SDS终止反应。用MD Spectra Max 190酶标仪(美国)在412 nm下测吸光度值A。平行3次实验,每次3个复孔。反应体系中以不加酶作为空白组2,不加抑制剂作为空白组1。根据公式(1)计算酶活抑制率:

.

(1)

1.5 连翘酯苷A敲除实验

Q2冻干粉末溶于DMSO中配制成80 mg/mL溶液,在Shimadzu LC-6AD液相仪(日本)进行连翘酯苷A敲除实验。进样量为400 μL。分析条件:Microsorb 100-5 C18 (21.4 mm×250 mm) 色谱柱,流速为0.8 mL/min,检测波长为280 nm,以色谱甲醇为流动相A,以质量分数0.3%醋酸水溶液为流动相B;梯度洗脱条件为:0～8 min,30%～33%(A),70%～67%(B);8～24 min,33%～40%(A),67%～60%(B);24～39 min,40%～48%(A),60%～52%(B);39～55 min,48%～64%(A),52%～36%(B)。22～26 min接出的样品即为敲除的连翘酯苷A。合并22 min之前和26 min之后的样品,即为敲除连翘酯苷A之后的剩余部分,我们定义为剩余物。将敲除的连翘酯苷A和剩余物部分分别冷冻干燥。

1.6 液相分析

将梯度洗脱物和剩余物样品分别用色谱甲醇配制成1 mg/mL溶液,用Agilent 1260高效液相色谱仪(德国)进行液相分析。进样量为10 μL。分析条件除色谱柱为Agela Technologies Venusil XBP-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)外,其他条件与‘1.5连翘酯苷A敲除实验’相同。

2 结果与讨论

2.1 不同乙醇浓度洗脱物对AChE酶活的抑制作用

不同乙醇浓度洗脱物对AChE酶活的抑制情况如表1所示,随洗脱物浓度的增大(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL),Q2、Q3和Q4对AChE的抑制作用均逐渐增强,其中Q2对AChE的抑制作用(IC50值为(0.44 ± 0.002)mg/mL)强于Q3和Q4对AChE的抑制作用,IC50值分别为(0.68 ± 0.002)和(1.12 ± 0.002) mg/mL;而Q1,Q5和Q6对AChE没有抑制作用,数据未显示。

表1 Q2,Q3和Q4对AChE的抑制作用(%),数据表示为means ± SEM (n=5)

由液相图(图1)可以看出,Q2主要成分为:连翘酯苷I、连翘酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A和芦丁。Q3主要包括:连翘酯苷I、连翘酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷。Q4主要成分为:连翘酯苷I、连翘酯苷B、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘酯苷A和连翘苷。根据图1得到的主要成分含量如表2所示:连翘酯苷A峰面积占比在Q2中是68.91%,Q3中为67.39%,Q4中是16.46%;而Q1,Q5和Q6中几乎没有连翘酯苷A。Q2和Q3中均含有连翘酯苷A,且含量相差无几,但Q2 比Q3有较强的AChE抑制活性。推测出现这种情况的原因可能为Q2中连翘酯苷A,芦丁和提取液中一些其他成分(连翘酯苷I、连翘酯苷B等)协同作用于AChE,增强了对AChE活性的抑制作用,根据上面实验结果,我们得到20%乙醇洗脱物对AChE的抑制效果较好,推测连翘酯苷A可能是其中的一种有效作用成分。

Q1, Q2, Q2, Q3, Q4, Q5 and Q6 represent water wash, 20%, 40%, 60%, 80% and 95% ethanol,respectively.A: Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside;D:Forsythiaside; E: Rutin; F: Phillyrin; G: Phillygenin.Fig.1 Liquid phase diagram of different extractsQ1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6分别代表0%,20%,40%,60%,80%和95%乙醇。A:连翘酯苷I;B:连翘酯苷B;C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷;D:连翘酯苷A;E:芦丁;F:连翘苷;G:连翘脂素。图1 不同乙醇浓度洗脱物的液相分析图

连翘酯苷I连翘酯苷B(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷连翘酯苷A芦丁连翘苷连翘脂素 Q2峰面积767.27170.6482.442 918.9542.21--百分比/%18.114.031.9568.911.00-- Q3峰面积494.90132.09338.492 925.9576.71235.3165.99 百分比/%11.403.047.8067.391.775.421.52 Q4峰面积39.07-38.85204.60-779.5032.48 百分比/%3.14-3.1216.46-62.701.92

2.2 青翘主要成分对AChE酶活的抑制作用比较

图2是连翘酯苷A和芦丁对AChE酶活的抑制作用图。由图可知,随连翘酯苷A浓度(5～400 μmol/L)和芦丁浓度(20～650 μmol/L)的增大,连翘酯苷A和芦丁对AChE的抑制作用均逐渐增强。其中连翘酯苷A对AChE酶活的抑制(IC50值为(45 ± 0.58)μmol/L)作用强于芦丁对AChE酶活的抑制(IC50值为(242 ± 2.91)μmol/L)。连翘脂素和连翘苷对AChE酶活几乎没有抑制作用,数据未显示。通过IC50比较,可以得出连翘酯苷A对AChE酶活的抑制作用最强。

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.2 Forsythiaside (A) or rutin (B) inhibited AChE activity数据表示为means ± SEM(n=3)图2 连翘酯苷A(A)和芦丁(B)对AChE的抑制作用

图1中,Q3的主要成分比Q2多了连翘苷和连翘脂素,但连翘苷和连翘脂素对AChE酶活几乎没有抑制作用,同时连翘酯苷A含量相近,所以Q3和Q2对AChE酶活的抑制作用相似。Q4的主要成分比Q2多了连翘苷和连翘脂素,但连翘酯苷A含量急剧降低,同时芦丁几乎不存在于Q4,而芦丁对AChE酶活也有较强抑制作用,所以Q4相比Q2对AChE酶活的抑制作用大幅降低。由此推测,连翘酯苷A是抑制AChE酶活的主要成分之一。

2.3 剩余物和混合物抑制AChE酶活研究

图3是Q2,敲除的连翘酯苷A和剩余物的液相分析图。Q2中,保留时间在28.6 min的峰(即图中D代表的峰)是连翘酯苷A;敲除的连翘酯苷A的液相分析图中,保留时间在28.8 min的峰(即图中D代表的峰)是连翘酯苷A,峰面积占比是100%,说明敲除部分完全是连翘酯苷A;剩余物的液相分析图中,保留时间在29 min的峰(即图中D代表的峰)是连翘酯苷A,峰面积是43.32,峰面积占比是0.92%,因此可以判断出,Q2中的连翘酯苷A基本敲除完全。

A:Forsythoside I; B: Forsythoside B; C: (+)-pinoresinol-β-D-glucoside; D:Forsythiaside; E: Rutin.Fig.3 Liquid phase diagrams of Q2, the knockout forsythiaside and remainderA:连翘酯苷I; B:连翘酯苷B; C:(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷; D:连翘酯苷A; E:芦丁图3 Q2部分,敲除的连翘酯苷A部分和剩余物部分的液相图

图4是连翘酯苷A标品的标准曲线图,根据标曲图计算出Q2和剩余物中连翘酯苷A浓度分别为0.26和0.007 mg/mL。为了验证连翘酯苷A是Q2中抑制AChE酶活的一种主要成分,根据Q2中连翘酯苷A与剩余物部分的占比,配制混合物,比较Q2、剩余物部分和混合物对AChE酶活的抑制作用。结果(图5)表明,随着浓度(0.2～1.2 mg/mL)的增大,剩余物和混合物对AChE的抑制作用都呈现增强的趋势。但和Q2相比,因为芦丁的存在,所以剩余物对AChE的抑制作用(IC50值为(0.52 ± 0.002) mg/mL)只有部分降低;而混合物中由于连翘酯苷A的重新加入,其对AChE的抑制(IC50值为(0.44 ± 0.003) mg/mL)作用与Q2的作用相当。推测出现这种情况的原因可能为将连翘酯苷A敲除后剩余成分由于协同作用,对AChE仍有抑制作用。又由于连翘酯苷A具有抑制AChE活性,所以混合物的抑酶活性略强于敲除后剩余部分。所以,最终确定连翘酯苷A是Q2中的一种有效作用成分。

Fig.4 Standard curve of forsythiaside.图4 连翘酯苷A标准品的标准曲线图

Data are represented as means ± SEM (n=3)Fig.5 Inhibitory effects of remainder (A) and mixture (B) on AChE.数据表示为means ± SEM(n=3)图5 剩余物(A)和混合物(B)对AChE的抑制作用

3 结论

本文主要利用Ellman法系统地考察青翘的不同浓度乙醇洗脱物(Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6)以及主要成分(连翘酯苷A,芦丁,连翘苷和连翘脂素)对AChE的抑制作用。结果表明,Q1,Q2,Q3,Q4,Q5和Q6对AChE的抑制作用研究中,Q2抑酶活性较高;青翘主要成分对AChE的抑制作用相比,连翘酯苷A对AChE的抑制作用强于芦丁,而连翘脂素和连翘苷对AChE的几乎没有抑制作用;结合液相图(Q2中连翘酯苷A的峰面积占比较大),我们推测连翘酯苷A在其中发挥了重要作用。根据敲除实验,证实连翘酯苷A是青翘中的一种有效作用成分。