王玲芝,严文瑞,汪青波,张立伟

(1.山西大学 分子科学研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西 太原 030006;2.山西大学 化学化工学院,山西 太原 030006;3.山西大学 中医药现代研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl)为落叶灌木,是木犀科连翘属植物的干燥果实,广泛分布于山西、河南、河北、陕西等地[1],以山西分布量最多[2]。连翘的果实为山西的道地药材之一,其具有清热解毒,消肿散结,疏散风热之功效,主要用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒、风热感冒、温病初起、温热入营等症[3]。连翘果实中含有苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、环己基乙醇衍生物及生物碱等化学成分[4],其中,苯乙醇苷类、木脂素类为连翘的两大类主要代表性特征性成分。迄今为止,已从连翘果实中分离得到连翘酯苷A-E、泽丁香酚苷、β-羟基泽丁香酚苷、木通苯乙醇苷B、松果菊苷等多个苯乙醇苷类化合物[5-6];连翘苷、连翘脂素、牛蒡子苷元、牛蒡子苷、罗汉松脂素、罗汉松脂苷、落叶松脂素等木脂素类化合物[7];此外,也从连翘果实中分离得到槲皮素、异槲皮素、木犀草苷、山柰酚、异鼠李素、芦丁、橙皮苷、木犀草素等黄酮类化合物[8]。现代药理学研究表明连翘中的苯乙醇苷类化合物具有心肌保护作用、神经保护作用、改善记忆力、保肝、抗辐射、抗氧化、抗菌等药理活性[9-10]。

目前,现行的连翘饮片的质量控制标准主要以连翘酯苷A和连翘苷两个单体成分的含量为控制指标,能否较全面地反映连翘的品质值得商榷。此外,连翘总苯乙醇苷和总木脂素类等大类成分的含量测定,可否作为连翘质量控制指标体系的补充也值得进一步探讨。目前针对连翘的苯乙醇苷单体成分的含量测定已建立了多种方法,如采用高效液相色谱法测定连翘酯苷A[11],反相高效液相色谱法同时测定连翘酯苷A和连翘酯苷B[12]、液质联用技术测定连翘酯苷F[13]、液质联用技术同时测定连翘中连翘酯苷H、连翘酯苷I、连翘酯苷J、连翘梾木苷A等苯乙醇苷的单体成分[14]。但连翘中的总苯乙醇苷的含量测定尚未见报道,因此,本文采用紫外分光光度法建立了连翘中总苯乙醇苷含量的测定方法,试图为较全面的连翘质量评价体系的建立提供依据。此外,利用建立的方法检测了青翘、老翘及连翘其他不同部位的总苯乙醇苷含量,拟为连翘植物非药用部位的综合利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Varian Cary 50型紫外-可见分光光度仪(美国瓦里安公司),SB-3200DTS 超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司),TGL-16M高速冷冻离心机(金坛市水北科普实验仪器厂),EX125DZH十万分之一天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司),先行者CP114万分之一电子天平(美国奥豪斯(上海)仪器有限公司),GZX-9070-MBE 数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司),IKA RV10 Basic数显型旋转蒸发仪(德国艾卡科技有限公司),LGJ-05冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司),Tecan Infinite M200 Pro多功能酶标仪(上海迪奥生物科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

连翘鲜果实于2017年8月20日采摘自山西大学校园,经本校分子科学研究所张立伟教授鉴定为木犀科连翘属植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.) Vahl的果实,蒸熟晒干,粉碎成末,过筛备用,用于含量测定方法学建立;青翘、老翘及连翘的根、茎、叶、花和主干含量测定样品于2017年采于山西平定县冠山;不同产地青翘总苯乙醇苷含量对比研究样品分别来自于山西平定、山西黎城、山西高平、山西沁水、山西屯留、河南辉县和河北以岭7个产地,青翘采摘期均为2017年8月。连翘酯苷A对照品(中国食品药品检定研究院,批号:79916-77-1);连翘苷对照品(纯度:质量分数99.1%,批号:MUST——17031610,成都曼思特生物科技有限公司);芦丁对照品(纯度:质量分数98%,批号:Y19N7S25244,上海源叶生物科技有限公司);甲醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂);FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Powder,铁离子还原/抗氧化能力法)试剂盒(碧云天生物技术有限公司),TPTZ(Tripyridyltriazine,三吡啶基三嗪)溶液;其他试剂均为分析纯,实验用水为蒸馏水。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的配制

取连翘酯苷A、连翘苷、芦丁对照品适量,精密称定,分别用体积分数70%甲醇(下同)溶解,得到连翘酯苷A浓度为0.105 mg/mL、连翘苷浓度为0.109 mg/mL、芦丁浓度为0.103 mg/mL,4℃保存,备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

按照药典方法[3]精密称定来自山西大学校园内的青翘粉末0.107 g (过五号筛),置具塞锥形瓶中,精密量取体积分数为70%甲醇3 mL,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷再称重,用70%甲醇补足失重,6 000 r·min-1离心20 min,取30 μL上清液,置于10 mL棕色容量瓶中,用70%甲醇稀释并定容至刻度,制得供试品溶液,4℃保存,备用。

2.2 方法学考察

2.2.1 检测波长的确定

以70%甲醇为空白对照,连翘酯苷A对照品和供试品溶液分别在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描,绘制两者的紫外吸收图谱进行比较,以确定最大吸收波长。

2.2.2 线性关系考察

精密量取连翘酯苷A对照品贮备液0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4 mL,分别置于10 mL棕色容量瓶中,加入70%甲醇定容至刻度,以70%甲醇为空白对照,于最大吸收波长处测定样品的吸光度。

2.2.3 精密度试验

取同一供试品溶液,连续测定6次,记录吸光度值代入线性回归方程,计算相对标准偏差值,评价方法的精密度。

2.2.4 重复性试验

按照“2.1”项下的方法配制6份供试品溶液，分别于最大吸收波长处测定吸光度，计算6份样品中总苯乙醇苷的含量，评价方法的重复性。

2.2.5 稳定性试验

按照“2.1”项下的方法配制供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10、12 h,按照总苯乙醇苷含量测定方法测定其吸光度,计算相对标准偏差值,考察样品的稳定性。

2.2.6 加样回收率实验

精密称取已知含量(112.04 mg·g-1)的同一批青翘样品9份,每份取50 mg,分成3组,每组3份,分别按实际样品中总苯乙醇苷含量的80%、100%、120%加入连翘酯苷A对照品。按照“2.1”项下的实验方法制备供试品溶液,测定吸光度,计算平均回收率和相对标准偏差值。

2.3 干扰试验

精密量取“2.1”项下配制的连翘苷对照品贮备液1 mL、芦丁对照品贮备液1.5 mL,分别置于10 mL棕色容量瓶中,加入70%甲醇定容至刻度,在200～400 nm波长范围内进行扫描,绘制连翘苷和芦丁对照品溶液的紫外吸收图谱,并与供试品溶液的紫外吸收图谱比较。

2.4 连翘植物不同部位及不同产地(青翘)总苯乙醇苷含量测定

按照供试品制备方法,分别制备青翘、老翘及连翘其他不同部位及不同产地(青翘)的供试品溶液。精密量取50 μL上述各供试品溶液置于10 mL棕色容量瓶中,用70%甲醇稀释并定容至刻度,摇匀。按照测定方法,以70%甲醇为空白对照,于200～400 nm波长范围内依法测定各供试品的吸光度值。根据标准曲线方程和下述公式,计算连翘植物不同部位及不同产地(青翘)中总苯乙醇苷的含量。

式中:C为提取液中总苯乙醇苷质量浓度(μg·mL-1);V为提取液体积(mL);W为取样量(mg);N为稀释倍数。

2.5 连翘植物不同部位总抗氧化能力的测定

在Benzie等[15]建立方法的基础上稍作改进,将TPTZ稀释液、TPTZ溶液、检测缓冲液按照体积比10∶1∶1混合均匀,配制成FRAP工作液。将样品配制成系列浓度,取5 μL样品溶液与180 μL FRAP工作液混合均匀,37℃孵育后于593 nm处测定其吸光度值,以蒸馏水代替样品作空白对照,平行操作3次。以FeSO4为标准品,按照上述方法,绘制标准曲线。样品的总抗氧化能力(FRAP值)以达到相同吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。

2.6 数据统计

所有实验均重复测定3次,实验结果表示为平均值±标准偏差。采用origin 8.0软件绘制作图。

3 实验结果

3.1 方法学考察

3.1.1 检测波长的确定

Fig.1 UV absorption spectrum of forsythiaside A reference substance and testing sample图1 连翘酯苷A对照品和供试品紫外吸收光谱图

Fig.2 Standard curve of forsythiaside A图2 连翘酯苷A标准曲线图

由图1可见,对照品与供试品紫外吸收图谱相似,两者在330 nm处均有最大吸收,因此,选择330 nm作为检测波长。

3.1.2 线性关系考察

日子就这样一天一天过去，没有什么进展，蒋海峰心里乱糟糟的。约她俩散步，紫云借故不参加，水仙芝也不去。课余时间，蒋海峰窜到水仙芝的座位上，看见一本相册，随手翻了几页，发现了一张发黄的毕业照，他家也有，他的父亲就在合影里。

以对照品溶液的浓度(mg/L)为横坐标,吸光度值(A)为纵坐标,绘制标准曲线(图2),计算得线性回归方程为:A=0.029 4C-0.001,R2=0.999 6。结果表明总苯乙醇苷质量浓度在6.28～25.10 mg/L范围内与吸光度具有良好的线性关系。

3.1.3 精密度试验

测定结果见表1。6次测定值重现性较好,RSD为0.23% (n=6),表明该测定方法精密度良好。

3.1.4 重复性试验

测定结果见表2。6份供试品溶液中苯乙醇苷平均含量为11.213%,RSD为1.31%,表明此方法重复性良好。

表1 精密度实验结果

表2 重复性实验结果

3.1.5 稳定性试验

测定结果见表3。计算得供试品溶液吸光度的RSD为0.46%,结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

表3 稳定性实验结果

结果如表4所示。9份样品的平均加样回收率为98.31%,RSD为1.54%,实验结果表明,本测定方法的回收率良好,准确可靠,可用于连翘中总苯乙醇苷的含量测定。

表4 加样回收率实验结果(n=9)

3.2 干扰试验结果

结果表明(图3),连翘苷最大吸收波长为280 nm,在300～400 nm范围内无吸收,说明木脂素类成分对于总苯乙醇苷的含量测定无干扰。芦丁在330 nm波长处有微弱吸收,说明黄酮类成分对于总苯乙醇苷的含量测定有较小干扰。

3.3 总苯乙醇苷含量测定结果

表5测定结果表明青翘、老翘及连翘其他不同部位中均含有苯乙醇苷类成分,含量高低依次为连翘根、主干、青翘、新茎、叶、老茎、花、老翘;其中,连翘茎、叶等作为连翘的非药用部位含有较高量的苯乙醇苷类成分。由表6可得出不同产地青翘中总苯乙醇苷含量有一定差异。

表5 不同部位总苯乙醇苷含量

表6 不同产地青翘中总苯乙醇苷的含量(n=3)

Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum of different samples图3 不同样品紫外吸收光谱

Fig.4 FRAP value of total antioxidant activity of forsythia in different parts图4 不同部位的总抗氧化能力比较

3.4 连翘植物不同部位总抗氧化能力的比较结果

FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝色的Fe2+-TPTZ,并于593 nm处有最大吸收,根据最大吸收波长处吸光度大小计算样品总抗氧化能力的强弱,FRAP值越大表示样品的总抗氧化能力越强[1-2，16]。FRAP值通过线性拟合的FeSO4标准曲线方程(Y=0.348X-0.0131,0.15～3.9 mg/mL,R2=0.999 6)进行换算,比较不同部位的总抗氧化能力。结果如图4。

由图4可知,在0.2～1.2 mg/mL浓度范围内,随着样品浓度的增大,样品的总抗氧化能力也逐渐增加,呈现剂量依赖关系。图4显示,连翘植物各部位均具有不同的总抗氧化能力,同一样品浓度下,连翘根部还原Fe3+的能力最强,在浓度为1.2 mg/mL时FRAP值为2.99 mmol/L。青翘、老翘及连翘其他不同部位总抗氧化能力的强弱表现为:连翘根>主干>青翘>侧枝>新茎>老茎>叶>花>老翘,与连翘植物不同部位中总苯乙醇苷含量高低顺序基本一致,研究结果表明总抗氧化能力强弱与总苯乙醇苷的含量具有显著的相关性。

4 讨论

连翘中的总苯乙醇苷是连翘的主要药理活性成分群,迄今为止,已从连翘果实中分离得到连翘酯苷(A～K)、毛柳苷[17-18]等多种苯乙醇苷类化学成分,它们的结构与连翘酯苷A相似,并具有良好的生物活性。此外,针对连翘的苯乙醇苷单体成分连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷F、连翘酯苷H、连翘酯苷I、连翘酯苷J、连翘梾木苷A等苯乙醇苷的单体成分的含量测定已建立了多种方法[11-14]。上述测定方法的建立虽然为连翘饮片的多活性指标的测定提供了依据,但由于标准物质的缺乏,这些技术方法尚未应用于连翘的标准中,目前现行国家药典中仍仅规定了连翘酯苷A和连翘苷的含量测定项。鉴于目前多活性指标的测定尚不能实现的现状,我们认为连翘中的总苯乙醇苷含量的测定对连翘质量控制指标体系的补充是有意义的。

连翘果实中主要含有苯乙醇苷和木脂素两大类化学成分,以及微量的黄酮类、生物碱、三萜类等物质。为了考察本文建立的总苯乙醇苷含量测定方法的专属性,本文重点考察了连翘果实含量较高且具有代表性的木脂素类成分连翘苷，以及连翘花中含量较高且具有代表性的黄酮类成分芦丁对总苯乙醇苷含量测定的干扰。研究结果表明,连翘中含量较高的木脂素类成分连翘苷对连翘果实、茎、叶和花中的总苯乙醇苷含量的测定基本没有干扰;连翘果实、茎中的黄酮类成分含量很少[19],因此,用本文建立的方法测定连翘果实、茎中的总苯乙醇苷含量时,黄酮类成分干扰较小;由于连翘花和叶中黄酮类成分芦丁含量相对较高,因此,用本方法测定连翘花、叶中的总苯乙醇苷含量时,会产生一定的干扰。

通过连翘植物不同部位总抗氧化能力与其总苯乙醇苷含量对比分析,结果表明连翘的总抗氧化能力与总苯乙醇苷含量成正相关,由此说明总苯乙醇苷是体现连翘具有总抗氧化能力的主要活性物质基础,其总抗氧化能力作用的机制后续还有待进一步研究。

此外,为了提高连翘果实的产量,需要每年对连翘植物进行修剪,并产生大量的茎、叶等废弃物,本研究发现连翘茎、叶中含有较高含量的苯乙醇苷类成分,提示应加大对茎、叶等废弃物中的苯乙醇苷类成分的应用研究,为连翘资源的综合利用提供基础。