郭东光，陈明艳，朱艳平，李 鹏，岳 锋，崔芳微,2，李文明,2，王金海，王选年

(1.新乡学院 生命科学技术学院，河南 新乡 453003； 2.郑州大学 生命科学技术学院，河南 郑州 450000)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪重要急性、烈性传染病，严重威胁着我国养猪业的发展，《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中将其列为5种优先防治的动物疫病之一[1-5]。疫苗免疫是目前预防和控制CSF发生和流行的重要手段[6-8]。

目前，常用的CSF疫苗主要有2种，一种是改良的活疫苗，其安全、有效，但不能从被免疫动物中区分野毒感染动物(Differentiation of infected from vaccinated animals，DIVA)[9]。另一种是E2亚单位疫苗，其能够辨别野毒感染，但免疫接种后不能快速启动免疫反应或不能通过胎盘传递给子代[10]。虽然标记疫苗能够区分DIVA，前提是要有准确、有效的配套辨别检测方法。由于CSFV结构蛋白E2是制备CSF标记疫苗的主要靶标蛋白。因此，最好的策略是对感染猪E0特异性抗体的鉴别[11]。

E0蛋白是CSFV的主要结构蛋白之一，具有重要的血清学鉴别功能，能够有效区分瘟病毒属中的CSFV、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和边界病病毒(Border disease virus,BDV)抗体，也是与CSF标记疫苗配套使用的重要检测蛋白[12-15]。相比传统的血清中和试验，ELISA检测技术更为方便可行，为临床上CSFV血清抗体监测提供了一种切实、可靠的检测工具[16-17]。鉴于此，通过原核表达纯化的E0重组蛋白，建立CSFV血清抗体的间接ELISA(E0-ELISA)检测方法，一方面为临床上CSFV血清抗体的筛查提供一种经济、方便的检测手段，另一方面也为在CSFV感染后早期血清分析和后期的DIVA配套试验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要材料 大肠埃希菌(E.coli)DH5α工程菌、Rostta(DE3)工程菌、质粒pGEX-CSFV全长质粒、原核表达载体pGEX-4T-2、猪瘟兔化阳性高免血清、CSFV抗体阳性血清140份、CSFV抗体阴性血清60份及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV) 、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)抗体阳性血清若干份均由新乡学院生物技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、核酸内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品；普通TaqDNA 聚合酶，为北京鼎国公司产品；抗GST标签单克隆抗体为北京中杉金桥生物公司产品；HRP标记的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均购于索莱宝公司；HRP标记的羊抗猪二抗，北京博士德生物公司产品；脱脂奶粉购自美国Amresco 公司；酶标板购自美国Thermo公司；牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；CSFV抗体检测试剂盒、PRV抗体检测试剂盒、PRRSV抗体检测试剂盒均为美国IDEXX公司产品；PCV抗体检测试剂盒为武汉前科动物生物制品有限公司产品；PPV抗体检测试剂盒为深圳绿诗源生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定 将pGEX-4T-2-E0阳性克隆子转化至BL21(DE3)大肠杆菌并加入IPTG进行诱导，经 SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况后，使用切胶回收方法对目的蛋白进行纯化。然后应用猪瘟兔化阳性高免血清及抗GST标签单克隆抗体进行Western blot分析，鉴定重组蛋白的生物学活性。

1.2.2 抗原最佳包被质量浓度和血清最适稀释度的确定 通过方阵滴定法测定抗原最适包被质量浓度和血清最佳稀释度，将E0蛋白分别按照0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL的质量浓度包被96孔酶标板，4 ℃过夜，PBST洗涤3次；用含5%脱脂奶粉的PBST每孔200 μL，37 ℃封闭2 h，PBST洗涤3次；再分别加入CSFV抗体阳性血清和阴性血清，每孔50 μL，以第1孔1∶25依次作倍比稀释，37 ℃作用30 min，PBST洗涤3次；然后每孔加入50 μL 1∶10 000稀释羊抗猪二抗稀释液， 37 ℃作用30 min；每孔加入80 μL底物显色10 min后，每孔加入100 μL 2 mol/L硫酸进行终止；最后在450 nm下测量各孔的OD值。判断标准：当OD值接近1，且测量值/阴性值(P/N)>2.1时，即为抗原最佳包被质量浓度和最适血清稀释度。

1.2.3 间接ELISA最佳反应条件的优化 在上述条件的基础上，又通过对抗原最佳包被时间(4 ℃过夜、37 ℃ 2 h、37 ℃ 3 h和37 ℃ 4 h)、封闭液的种类及用量(5%脱脂奶粉溶液、0.5% BSA、1% BSA和2% FBS)、封闭液作用时间(4 ℃ 过夜，37 ℃ 1、2、3、4 h)、血清最适作用时间(37 ℃下反应 30、60、90、120 min)、二抗最佳稀释比例(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)和最适二抗孵育时间(37 ℃作用15 min、30 min、1 h、2 h)进行优化，450 nm下测量各组各孔的OD值。判断标准：当P/N最大时，所对应的条件即为最佳作用条件。

1.2.5 特异性分析 用上述已优化方法检测PCV、PPV、PRRSV、PRV猪阳性血清抗体样品，以CSFV阳性血清和阴性血清为对照，检测该方法的特异性。

1.2.6 敏感性分析 将CSFV抗体阳性血清进行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280稀释，根据ELISA临界值判断标准判断该方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验 分别用同一批制备(批内)的重组E0蛋白包被的96孔酶标板和不同批次制备(批间)的重组E0蛋白包被的96孔酶标板，分别将7份CSFV抗体阳性血清和3份阴性血清按已优化方法分别重复检测6次，进行批内和批间重复性试验，确定建立检测方法的重复性和稳定性。

1.2.8 符合率检测 随机选取用IDEXX CSF抗体检测试剂盒检测的200份猪血清样品，再用建立的检测方法检测， 450 nm下测量OD值，根据临界值判断标准进行结果判定，比较两者的符合率。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白E0表达的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定

SDS-PAGE分析结果表明，pGEX-4T-2-E0阳性克隆子经0.1～1.0 mmol/L 的IPTG诱导后，均在预期位置46.0 ku处出现了目的条带，且IPTG浓度在1.0 mmol/L时表达量最高(图1)。Western blot结果显示，重组蛋白E0不仅与抗GST标签单克隆抗体反应，而且还与猪瘟兔化阳性高免血清反应，在46.0 ku左右也出现了特异性目的条带(图2)。以上结果表明，融合蛋白被正确表达且具有良好的生物学活性，纯化后的 E0重组蛋白可以作为ELISA检测方法的包被抗原。

M.蛋白质分子质量标准； 1—6：IPTG浓度分别为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L； 7.未诱导对照； 8.pGEX-4T-2(DE3)空载体M.Protein molecular weight; 1—6.The dose of 1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mmoL/L of IPTG; 7.Uninduced control; 8.pGEX-4T-2(DE3) control图1 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析结果 Fig.1 SDS-PAGE analysis results of recombinant protein expression

M.蛋白质分子质量标准； 1.未诱导对照； 2.重组蛋白E0与猪瘟兔化阳性高免血清反应； 3.重组蛋白E0与抗GST标签单克隆抗体反应； 4.pGEX-4T-2(DE3)空载体M.Protein molecular weight; 1.Uninduced control; 2.Results of E0 recombinant protein with rabbit serum that anti CSFV; 3.Results of E0 recombinant protein with anti GST mAb; 4.pGEX-4T-2(DE3) control图2 重组蛋白E0的Western blot 鉴定结果 Fig.2 Western blot identification results of E0 recombinant protein

2.2 抗原最适包被质量浓度和待检血清最适稀释度

由表1可知，根据方阵滴度法判断标准，当OD值接近1，且P/N>2.1时，即为抗原最适包被质量浓度和血清最适稀释度。结果显示，抗原最适包被质量浓度为1.0 μg/mL，待检血清最适稀释度为 1∶100。

表1 抗原最适包被质量浓度和血清最适稀释度测定结果Tab.1 The results of optimal antigen coating mass concentration and serum optimal dilution

2.3 E0-ELISA最佳反应条件的优化

通过对各反应条件的优化，E0-ELISA最佳反应条件分别为：抗原在37 ℃条件下包被1 h时，其P/N值最大，为4.230；使用5%脱脂奶粉溶液在 37 ℃条件下封闭 2 h时，P/N 值最大，为3.765；重组蛋白E0在37 ℃条件下封闭3 h时，P/N 值最大，为3.833；阳性血清在37 ℃条件下作用60 min时，P/N 值最大，为4.278；二抗在1∶5 000稀释时，孵育时间45 min，P/N值达到最大。

2.4 E0-ELISA阴性临界值

由表2可知，用E0-ELISA共检测60份CSFV阴性血清，其阴性血清OD450平均值为0.313，标准差为0.019，根据公式:阴性临界值=OD450+3SD，确定其阴性血清临界值为0.370，当样本OD450<0.370时,判断为阴性，反之则判断为阳性。

2.5 E0-ELISA的特异性分析

由表3可知，用E0-ELISA分别检测PRV、PRRSV、PCV、PPV的猪阳性血清20份，且每份重复3次，同时设立CSFV阳性和阴性对照，结果显示，OD450均小于临界值判断标准0.370，全部判断为阴性结果，说明该检测方法具有良好的特异性。

表2 E0-ELISA阴性临界值的测定结果Tab.2 The results of threshold for the E0-ELISA

2.6 E0-ELISA的敏感性分析

由图3可知，用E0-ELISA对2倍倍比稀释后的CSFV阳性抗体血清进行检测，当血清稀释至1∶640时，OD450仍大于所设定的临界值判断标准，结果判断为阳性，表明该方法敏感性良好。

表3 E0-ELISA的特异性分析结果Tab.3 Specificity analysis results for the E0-ELISA

图3 E0-ELISA的敏感性试验结果Fig.3 The sensitivity test results for the E0-ELISA

2.7 E0-ELISA稳定性分析

由表4可知，用同一批(批内)制备的重组蛋白E0包被的 96 孔酶标板和不同批次(批间)制备的重组蛋白E0包被的 96 孔酶标板，分别对7份阳性CSFV血清样品和3份阴性血清样品进行检测，得到批内变异系数为1.99%～7.69%，批间变异系数为2.16%～9.23%，两者均小于10%，说明该检测方法具有较好的稳定性和重复性。

表4 E0-ELISA 的重复性试验结果Tab.4 Repeatability assay results for the E0-ELISA

2.8 E0-ELISA符合率分析

由表5可知，经对200份猪血清样品进行检测，IDEXX试剂盒共检出140份CSFV血清阳性样品和60份阴性样品。E0-ELISA共检测出150份CSFV血清阳性样品和50份阴性样品，其中在150份阳性样品中有13份样品IDEXX试剂盒检测为阴性，在50份CSFV血清阴性样品中有3份IDEXX试剂盒检测为阳性。经计算，与IDEXX CSFV血清抗体试剂盒相比，E0-ELISA检测方法的的符合率为92.00%，敏感性为97.86%，特异性为78.33%。

表5 E0-ELISA符合率检测结果Tab.5 The results of coincidence rate for the E0-ELISA

3 结论与讨论

CSF标记疫苗的应用为CSF净化提供了重要手段，前提条件是要具备配套的鉴别诊断方法，由于E2结构蛋白是设计CSF标记疫苗的首选蛋白，为此，临床上对E0特异性抗体的检测成为有效辨别CSFV野毒感染的重要检测靶标[11]。本研究以大肠杆菌中表达的CSFV结构蛋白E0为包被原，建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，经鉴定该方法具有较高的敏感性，达到97.86%。PANNHORST等[18]设计并评价了2种使用细菌表达E0重组蛋白的间接ELISA(一种用于筛选，另一种用于确认)，2种ELISA都在感染后10 d内检测出不同毒株和基因型的CSFV特异性抗体，其能够有效区分CSFV感染猪和CP7_E2alf疫苗免疫猪，其敏感性和特异性为95%。MEYER等[11]建立了检测E0特异性抗体的双抗原夹心ELISA，也可有效识别不同基因型CSFV E0特异性抗体，其敏感性仅为90.2%，特异性为93.8%。相比之下，在敏感性方面该方法要明显优于前人所建立的类似检测方法。袁莉等[19]以E0蛋白为包被源也建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，结果表明,当CSFV阳性血清稀释至1∶640时，其结果判断为阴性，而该方法当血清稀释至1∶1 280时结果判断为阴性，说明本检测方法的敏感性更高。从结果来看，虽然本检测方法的特异性较低，这可能与本研究使用的临床样本较少相关，特别是阴性血清样本较少，仅有60份。

CSF标记疫苗是实施CSF净化的重要手段。为进一步证实该方法的可靠性，本研究对200份猪血清样品的检测结果表明，与IDEXX试剂盒的符合率达到92.00%。吴素丽等[20]以原核表达的E0蛋白为基础建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，与IDEXX试剂盒相比，其符合率仅为83%。李鹏等[21]也以原核表达的E0蛋白为基础建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，其总体符合率仅为89%。蔺辉星等[22]以原核表达的E2蛋白建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，其敏感性、特异性和符合率分别为 89.07%、77.59% 和 84.65%。与以上研究相比，本研究建立的检测方法的准确性和可靠性均明显提升。

综上所述，本研究成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法，临床上为CSFV抗体的监测提供了一种经济、有效的检测手段。本研究建立的检测CSFV结构蛋白E0抗体的ELISA检测方法可以作为未来鉴别感染和免疫的候选方案，为未来我国实现CSF的净化提供技术支持。