杨 莉 郏建臣 王玉华 刘红玲 申振亚

(河南科技大学第一附属医院开元院区急诊科，洛阳471023)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是指除心源性之外的致病因素，如脓毒症、再灌注损伤、失血性休克、烟雾及有毒气体吸入等病因引起的急性进行性呼吸衰竭[1]。其病理多表现为肺泡毛细血管及肺泡上皮细胞损伤，肺泡水肿、炎症浸润并充满富含蛋白质的液体，形成透明膜并出现肺间质纤维化现象[2]。近年来ALI发病率居高不下，病死率高达50%[3]。现阶段，对ALI症状多采用呼吸支持疗法并伴用镇静止痛药，但其不能从根本上减轻ALI导致的病理损伤。因此，寻找减轻ALI病理损伤的有效方法对降低ALI病死率十分重要。研究表明，桑黄素(Morin)可通过降低NOD样受体NLRP3炎症小体产生抑制炎症反应的发生，减轻ALI导致的病理损伤[4]。作为一类抗炎药物，桑黄素还可通过阻碍NF-κB信号通路抑制多种组织细胞炎症反应的发生[5,6]。据报道，NF-κB信号通路在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的ALI中被过度激活，并诱导促炎症因子的产生，阻碍NF-κB信号通路有助于减轻ALI病理损伤[7]。目前在ALI中，还没有关于桑黄素与NF-κB信号通路作用机制的报道。因此本文通过建立体内外ALI模型，探究桑黄素对NF-κB信号通路的作用及此机制对ALI的影响，为寻找ALI有效治疗方法提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1脂多糖、桑黄素及胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF-1)购自美国Sigma；HE染色试剂盒、Tunel细胞凋亡检测试剂盒、CCK8试剂盒及BCA试剂盒购自上海碧云天；肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)、IL-6、IL-1β、ELISA试剂盒、Trizol试剂购自美国Invitrogen；购自美国Invirtrogen；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)试剂盒购自南京建成；酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoryl-ated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K)、磷酸化丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphoryl-ated serine-threonine protein kinase，p-Akt)及3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase,GAPDH)抗体购自美国Cell Signaling Technology；磷酸化NF-κB(p-IκBα)及NF-κB p65抗体购自美国Santa Cruz；PCR引物利用Primer 3网站设计，由北京六合华大基因合成；反转录试剂盒及实时定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher；实验所用二抗均购自北京中杉金桥。

1.2方法

1.2.1大鼠分组及ALI模型的建立 将大鼠分为Control、LPS、morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组。腹腔注射LPS(10 mg/kg)诱导大鼠产生ALI，Control组除外。给药组随后腹腔注射相应浓度的桑黄素，Control及LPS组注射等量的生理盐水。7 d后处死各组大鼠，收集大鼠外周血及肺组织，称量右肺干湿重并计算肺干湿重比，将组织进行石蜡包埋，用于后期检测。

1.2.2HE染色检测肺损伤情况 将组织切片脱蜡，苏木精染色液中处理10 min，洗涤后伊红复染，脱水后封片。显微镜观察切片，蓝紫色为细胞核，红色为细胞质及细胞外基质。

1.2.3Tunel检测肺组织凋亡细胞百分比 组织切片脱蜡及修复后，利用内源性过氧化物酶封闭5 min。PBS洗涤，滴加Tunel检测液37℃避光孵育60 min。PBS洗涤，滴加DAB显色液进行显色，并利用苏木精复染，于暗室显微镜观察切片，棕色为凋亡细胞，蓝色为正常细胞。

1.2.4ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度 各组大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度测定步骤参考Invitrogen ELISA试剂盒说明书。避光显色后，利用酶标仪检测各组样品OD值，按说明书公式计算其浓度。

1.2.5CCK8检测大鼠原代肺巨噬细胞活性 将分离得到的大鼠原代肺巨噬细胞以1×105个/ml的浓度接于6孔板后培养24 h，然后分别用0、10、20、50、100、200 μmol/L的桑黄素处理细胞，24 h后检测细胞存活率。选取存活率≥80%、梯度较高的作为用药浓度。

1.2.6细胞分组处理及培养 将大鼠原代肺巨噬细胞分为Control、LPS、morin(10 μmol/L)、morin(20 μmol/L)、morin(50 μmol/L)及morin(50 μmol/L)+IGF-1组，LPS(1 μg/ml)诱导细胞损伤，Control组除外。给药组细胞用相应浓度桑黄素处理，morin(50 μmol/L)+IGF-1组用50 μmol/L桑黄素及0.1 μg/ml IGF-1共同处理。细胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640进行培养，细胞培养箱条件为5%CO2、37℃。

1.2.7RT-PCR检测TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平 将1.2.6中各组细胞中加入Trizol，在通风橱内进行总RNA抽提，步骤参考总RNA提取试剂盒说明书。定量分析后，进行反转录，每组取等量的RNA 反转录为cDNA，步骤参考反转录试剂盒说明书。最后利用RF PCR试剂盒对各样品进行定量分析。

1.2.8免疫印迹检测蛋白表达 RIPA裂解

1.2.1中各组肺组织及1.2.6中各组细胞，进行蛋白提取。BCA试剂盒定量并调平各组浓度。取各组蛋白30 μg，通过10%SDS-PAGE将蛋白分离，半干转膜法将蛋白转移到PVDF膜上。牛奶室温封闭2 h，一抗4℃过夜，二抗37℃孵育1 h，曝光显色，以GAPDH为内参。

1.3统计学分析 本文实验数据通过统计软件SPSS17.0进行分析。先进行正态分布分析和方差齐性分析，符合条件的选用单因素方差分析或t检验，不符合条件的选用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1桑黄素对ALI大鼠肺水肿的影响 与Control组比较，LPS组大鼠肺干湿重比值显著升高(P<0.01，图1)，与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中大鼠肺干湿重比值显著降低(P<0.05，P<0.01，图1)。表明桑黄素可抑制ALI中的肺水肿。

2.2桑黄素对ALI大鼠组织病理变化的影响 Control组中大鼠肺组织规则正常，肺泡清晰且结构完整。与Control组比较，LPS组大鼠肺组织杂乱无序，肺泡壁增厚，肺泡中炎症细胞浸润，充满红细胞及蛋白渗出物，肺泡结构被破坏。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)组大鼠肺泡中红细胞及蛋白渗出物有所减少，肺泡结构破坏有所减轻；morin(20 mg/kg)组大鼠肺泡中炎症细胞浸润、红细胞及蛋白渗出物显著减少；morin(40 mg/kg)组大鼠肺组织排列有序，肺泡壁变薄，肺泡中炎症浸润及渗出物显著减少，肺泡结构趋于正常。表明桑黄素可改善ALI引起的病理变化(图2)。

2.3桑黄素对ALI大鼠组织细胞凋亡的影响 与Control组比较，LPS组大鼠肺组织中凋亡细胞百分比显著升高(P<0.01，图3)。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中凋亡细胞百分比显著降低(P<0.05，P<0.01，图3)。此外，与Control组比较，LPS组大鼠肺组织中Bcl-2的表达显著减少，Bax及cleaved Caspase-3的表达显著增加(P<0.01，图4)。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中Bcl-2的表达显著增加，Bax及cleaved Caspase-3的表达显著减少(P<0.05，P<0.01，图4)。实验结果表明，桑黄素可减轻ALI引起的细胞凋亡。

图1 各组大鼠中的肺干湿重比值Fig.1 Ratio of lung wet/dry weight in rat of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

图2 各组大鼠肺组织的病理变化Fig.2 Pathology of lung tissue in rat of each group

图3 各组大鼠肺组织中的凋亡细胞百分比Fig.3 Apoptosis rate of cells in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.4桑黄素对ALI大鼠炎症反应的影响 与Control组比较，LPS组大鼠外周血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度显著升高(P<0.01，图5)。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度显著降低(P<0.05，P<0.01，图5)。表明桑黄素可抑制ALI引起的炎症反应。

2.5桑黄素对ALI大鼠组织氧化应激的影响 与Control组比较，LPS组大鼠肺组织中SOD浓度显著下降，MDA浓度显著上升(P<0.01，图6)。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中SOD浓度显著上升，MDA浓度显著下降(P<0.05，P<0.01，图6)。表明桑黄素可减轻ALI引起的氧化应激。

图4 各组大鼠肺组织中Bcl-2、Bax及cleaved Caspase-3的表达水平Fig.4 Expression level of Bcl-2,Bax and cleaved Caspase-3 in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

图5 各组大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度Fig.5 Concentration of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rate serum of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group,#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.6桑黄素对ALI大鼠组织中PI3K/Akt/NF-κB信号通路的影响 与Control组比较，LPS组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表达水平显著升高(P<0.01，图7)。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表达水平显著降低(P<0.05，P<0.01，图7)。表明桑黄素可抑制ALI组织中PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活。

2.7桑黄素对大鼠原代肺巨噬细胞存活率的影响 当桑黄素浓度达到100 μmol/L时，大鼠原代肺巨噬细胞存活率低于80%。故设置桑黄素用药浓度为10、20、50 μmol/L，用于后续实验(图8)。

2.8桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞中炎症因子的影响 与Control组比较，LPS组大鼠原代肺巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著升高(P<0.01，图9)。与LPS组比较，morin(10 μmol/L)组差异无显著统计学意义；morin(20 μmol/L)及morin(50 μmol/L)组中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著降低(P<0.01，图9)。表明桑黄素可抑制ALI中肺巨噬细胞产生TNF-α、IL-6及IL-1β。

图6 各组大鼠肺组织中的SOD及MDA浓度Fig.6 Concentration of SOD and MDA in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

图7 各组大鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表达水平Fig.7 Expression of p-PI3K,p-Akt,p-IκBα and NF-κB p65 in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.9桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路的影响 与Control组比较，LPS组大鼠原代肺巨噬细胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表达水平显著升高(P<0.01，图10)。与LPS组比较，morin(10 μmol/L)、morin(20 μmol/L)及morin(50 μmol/L)组中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表达水平显著降低(P<0.05，P<0.01，图10)。表明桑黄素可抑制ALI中肺巨噬细胞PI3K/Akt/NF-κB信号通路的激活。

2.10IGF-1减弱桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞NF-κB活化的抑制作用 与Control组比较，LPS组大鼠原代肺巨噬细胞中p-IκBα和NF-κB p65的表达显著增加。与LPS组比较，morin(50 μmol/L)组中p-IκBα和NF-κB p65的表达显著减少。与morin(50 μmol/L)组比较，morin(50 μmol/L)+IGF-1组中p-IκBα和NF-κB p65的表达显著增加(P<0.01，图11)。IGF-1是PI3K/Akt信号通路的强效激活剂，表明PI3K/Akt信号通路激活可减弱桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞中NF-κB活化的抑制作用。

图8 不同浓度的桑黄素对大鼠原代肺巨噬细胞存活率的影响Fig.8 Effect of different morin concentration on rat pulmonary macrophage viabilityNote: n=6.

图9 各组细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平Fig.9 mRNA level of TNF-α,IL-6 and IL-1β in cell supernatant of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group.

图10 各组细胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表达水平Fig.10 Expression level of p-PI3K,p-Akt,p-IκBα and NF-κB p65 in cells of each groupNote: **.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

图11 各组细胞中p-IκBα和NF-κB p65的表达水平Fig.11 Expression level of p-IκBα and NF-κB p65 in cells of each groupNote: **.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group；&&.P<0.01 versus morin(50 μmol/L)group.

图12 各组细胞培养上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平Fig.12 mRNA level of TNF-α,IL-6 and IL-1β in cell supernatant of each groupNote: n=6,**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group；&&.P<0.01 versus morin(50 μmol/L) group.

2.11IGF-1减弱桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞炎症反应的抑制作用 与Control组比较，LPS组大鼠原代肺巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著升高。与LPS组比较，morin(50 μmol/L)组中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著降低(P<0.01，图12)。与morin(50 μmol/L)组比较，morin(50 μmol/L)+IGF-1组中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平显著升高。表明NF-κB的活化减弱桑黄素对ALI大鼠原代肺巨噬细胞炎症反应的抑制作用。

3 讨论

桑黄素(3,5,7,20,40-五羟黄酮)是一类黄体酮类化合物，可从密耳、杏仁壳及无花果等植物中分离得到。据报道，桑黄素具有多种生物学功能，可保护心血管细胞、肾小球细胞、肝细胞、少突胶质细胞及神经元细胞抵抗氧化应激损伤[8]。同时，桑黄素可通过阻碍NF-κB信号通路抑制多种组织细胞炎症反应的发生[5,6]。而在ALI中，NF-κB信号通路被过度激活，促进肺组织炎症反应的发生[7]。因此，本文探索了在ALI中桑黄素对NF-κB信号通路的作用，并检测了此机制对ALI产生的影响。

在ALI中，肺组织细胞大量死亡，引起肺泡水肿及肺组织间质纤维化，因此，抵抗细胞凋亡、水肿及组织纤维化可缓解ALI造成的损伤。研究表明，桑黄素具有显著的抗凋亡及抗纤维化作用，它可保护胃黏膜细胞避免吲哚美辛诱导的细胞凋亡，帮助肝细胞抵抗氧化应激诱发的细胞凋亡，并抑制二甲基亚硝胺诱导的肝组织纤维化[5,9,10]。本文研究发现，与Control组比较，LPS组大鼠肺干湿重比值显著升高，肺泡中充满红细胞及蛋白渗出物。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中大鼠肺干湿重比值显著降低，肺泡中红细胞及蛋白渗出物显著减少。此外，桑黄素可降低ALI大鼠组织凋亡细胞百分比及Bax和cleaved Caspase-3的表达，升高Bcl-2的表达。同时，随着桑黄素浓度由10 mg/kg升高至40 mg/kg，其产生的作用愈加明显。LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成部分，与肺损伤形成密切相关，常被用于建立ALI的动物模型，诱导肺部组织产生炎症[11]。Bax作为一类促凋亡蛋白，可诱导Caspase-9和Caspase-3前体的激活[12]。cleaved Caspase-3作为Caspase-3的活化形式，是凋亡程序中的关键执行蛋白[13]。Bcl-2作为一类抗凋亡蛋白，可通过抑制Bax表达降低细胞凋亡水平[14]。实验结果说明，桑黄素可减轻ALI导致的肺泡水肿及细胞凋亡，抑制肺组织纤维化的形成。

据报道，桑黄素具有显著的抗炎作用，可抑制铂类化合物引起的肾脏及肝脏炎症反应，减轻哮喘导致的支气管上皮细胞炎症[15，16]。也有研究表明，桑黄素可显著降低糖尿病模型大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β及IL-6的产生[17]。TNF-α、IL-1β及IL-6均为促炎症细胞因子，可刺激肺泡巨噬细胞和呼吸道上皮细胞释放趋化因子，诱导单核巨噬细胞表达黏附分子，促进炎症反应的发生[18]。此外，TNF-α和IL-1β还可诱导其他细胞炎症因子的表达并激活NF-κB信号通路，进一步扩大炎症反应的发展[19]。本文中，桑黄素降低ALI模型大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的浓度及LPS处理后大鼠原代肺巨噬细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。并且，随着桑黄素浓度的升高，其对促炎症细胞因子的抑制作用愈明显。表明桑黄素可抑制ALI炎症反应的发生发展。

研究表明，氧化应激是ALI发病机制的关键因素之一，可引起细胞内活性氧显著增加，导致蛋白质、脂质及DNA发生硝化或氧化，造成肺组织损伤严重[20]。抑制氧化应激可减轻ALI产生的影响。据报道，桑黄素可抑制多种因素诱导的氧化应激，如在大鼠肝脏组织中，桑黄素可抑制环磷酰胺诱导的氧化应激[21]。在糖尿病模型小鼠脑组织中，桑黄素可抑制链脲霉素诱导的氧化应激[17]。同时，桑黄素还可保护细胞抵抗γ-辐射引起的氧化应激，减轻细胞膜脂过氧化现象及DNA损伤[22]。本文研究发现，与Control组比较，LPS组大鼠肺组织中SOD浓度显著下降，MDA浓度显著上升。与LPS组比较，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)组中SOD浓度显著上升，MDA浓度显著下降，且随着桑黄素浓度的升高，此效果愈明显。SOD是机体内清除活性氧的主要酶类之一，可保护细胞膜结构完整，MDA是脂质的氧化产物，可作为检测组织氧化损伤水平的指标[23]。实验结果表明，桑黄素可减轻ALI氧化应激造成的病理损伤。

NF-κB信号通路在ALI中被过度激活，并参与肺组织炎症反应的形成[7]。而桑黄素可抑制多种细胞中NF-κB信号通路的激活，并阻碍炎症反应的发生，如在胃黏膜细胞中，桑黄素可通过抑制NF-κB信号通路保护细胞抵抗吲哚美辛诱导的炎症反应和细胞凋亡[5]。在小鼠巨噬细胞中，桑黄素可通过阻碍NF-κB信号通路抑制尿酸钠晶体诱导的炎症免疫反应[6]。也有研究表明，在原代牛乳腺上皮细胞中，桑黄素可通过抑制NF-κB磷酸化降低促炎症细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达[24]。本文中，桑黄素可降低ALI模型大鼠肺组织及原代肺巨噬细胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表达。并且随着桑黄素浓度的升高，其产生的抑制作用越明显。而当桑黄素与PI3K/Akt信号通路强效激活剂IGF-1共同作用于ALI模型原代肺巨噬细胞时，p-IκBα和NF-κB p65的表达水平显著升高，TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平亦显著升高。在PI3K/Akt信号通路中p-PI3K通过第二信使促使Akt活化，p-Akt通过磷酸化IκB激酶促使NF-κB激活，NF-κB p65是NF-κB的入核形式，对炎症反应各阶段中的细胞因子具有调节作用[25]。实验结果提示，桑黄素可通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路降低ALI中TNF-α、IL-6和IL-1β的产生。

综上所述，本文研究发现，桑黄素可缓解ALI导致的肺泡水肿及细胞凋亡，抑制肺组织纤维化的形成。同时，桑黄素可减轻ALI氧化应激造成的病理损伤。此外，桑黄素可通过阻碍PI3K/Akt/NF-κB信号通路降低TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，抑制ALI中肺组织中炎症反应的发生。本文深入研究了桑黄素对LPS诱导ALI大鼠的保护作用及机制，为桑黄素临床应用提供理论基础。