李云峰（通讯作者） 杨丕波 王瑾

（1 湖北省第三人民医院＜湖北省中山医院〉口腔科 湖北 武汉 430033）

（2 华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔科 湖北 武汉 430030）

口腔鳞癌的发病机制被越来越多的研究证实与表观遗传学中的基因甲基化异常有关，可用于口腔鳞癌的病情及预后评估，可能较传统的蛋白质水平的肿瘤标志物具有更高的灵敏度及特异性[1,2]。Ras相关区域家族1A（RASSF1A）为调控细胞周期的抑癌基因，其甲基化异常被多个研究证实与多种恶性肿瘤的发病机制密切相关[3,4]，但在口腔鳞癌方面尚无相关研究。本研究检测口腔鳞癌患者口腔脱落细胞RASSF1A基因甲基化，研究其在口腔鳞癌病情及预后评估中的价值。

1.资料与方法

1.1 临床资料

研究对象为2015年1月-2019年1月诊治的口腔鳞状细胞癌患者（鳞癌组），纳入标准：（1）口腔检查、颅脑磁共振和口腔活检或术后病理组织学确诊；（2）首次诊治，既往无口腔鳞癌病史及未行手术、放疗及化疗治疗史；（3）无合并其他肿瘤性疾病；（4）知情并同意本研究。鳞癌组患者共纳入80例研究对象。另选择同期门诊行口腔体检的正常健康人为对照（对照组）。鳞癌组和对照组研究对象在性别、年龄、体质量指数及吸烟史方面均具有可比性，差异均无统计学意义，见表1。

表1 鳞癌组和对照组研究对象基本资料比较

1.2 RASSF1A基因甲基化检测

鳞癌组和对照组研究对象均采用细胞刷刷取口腔脱落细胞，鳞癌组取材部位为病变处。提取口腔脱落细胞基因组总DNA后采用基因甲基化特异性PCR法检测RASSF1A基因甲基化，采用Methprimer 2.0设计引物，引物序列见表2，反应体系为50μL，反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环，最后一个循环72℃延伸6min。扩增产物经凝胶电泳后显色判断结果（根据M和U扩增条带判断，结果为甲基化和未甲基化），见表2。

表2 甲基化特异性PCR法检测RASSF1A甲基化引物序列

1.3 统计学分析

数据采用SPSS12.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 RASSF1A甲基化比较

鳞癌组口腔鳞癌患者中检测出RASSF1A甲基化56例，RASSF1A甲基化率为70.0%，对照组正常健康人中检测出RASSF1A基因甲基化2例，RASSF1A甲基化率为2.5%，鳞癌组患者RASSF1A甲基化率显著高于对照组（P＜0.001）。

2.2 RASSF1A甲基化与临床病理因素的关系

本组80例口腔鳞癌患者RASSF1A甲基化率在性别、年龄和病灶部位中无统计学差异（P＞0.05），在吸烟史、分化程度、肿瘤最大径和TNM分期中的差异均具有统计学意义（P＜0.05），有吸烟史、分化程度低、肿瘤最大径≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A甲基化率显著无吸烟史、中＋高分化程度、肿瘤最大径＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，见表3。

表3 口腔鳞癌不同临床病理因素RASSF1A甲基化的差异

3.讨论

口腔鳞癌的发病机制与基因突变和表观遗传学改变有关，其中表观遗传学是新近发现的与DNA碱基序列突变无关的基因表达调控机制，而基因甲基化修饰是表观遗传学最常见的调控机制[5]。研究表明，基因启动子区域CG甲基化修饰后，甲基化CG自身或结合甲基结合蛋白后可阻遏转录因子与结合，从而发挥转录前调控作用，基因异常甲基化可用于肿瘤的病情及预后评估[6]。RASSF1A为调控细胞周期的抑癌基因，其甲基化异常与多种恶性肿瘤的发生、发展及转归密切相关[7,8]。本研究中，采用甲基化特异性PCR检测口腔鳞癌患者口腔脱落细胞RASSF1A基因甲基化，发现其RASSF1A基因甲基化率显著高于对照组正常健康人，表明RASSF1A基因甲基化可能与口腔鳞癌的发病机制密切相关。

越来越多的研究证实表观遗传学的基因甲基化可用于口腔癌的病情及预后评估，与传统的肿瘤标志物相比具有更高的特异性及灵敏度[9,10]。本研究比较口腔鳞癌患者口腔脱落细胞RASSF1A甲基化在不同临床病理因素中的差异，发现RASSF1A基因甲基化率在性别、年龄和病灶部位中无统计学差异（P＞0.05），在吸烟史、分化程度、肿瘤最大径和TNM分期中的差异均具有统计学意义（P＜0.05），有吸烟史、分化程度低、肿瘤最大径≥3cm和Ⅲ+Ⅳ患者RASSF1A基因甲基化率显著高无吸烟史、中＋高分化程度、肿瘤最大径＜3cm和Ⅰ+Ⅱ患者，这些证据表明口腔脱落细胞RASSF1A基因甲基化可作为口腔鳞癌病情严重及预后评估的基因水平标志物，与术后切除标本检测相比，口腔脱落细胞的检测可在术前为口腔鳞癌的病情及预后评估提供客观证据，更具有临床价值。

综上所述，RASSF1A基因在口腔鳞癌中呈甲基化状态，与吸烟史、分化程度、肿瘤最大径和TNM分期密切相关，在口腔鳞癌病情及预后评估中具有重要临床价值。