‘海尔特兹’树莓组织培养及其叶柄再生体系的建立

2019-11-16刘丽高登涛魏志峰郭俊英李秋利刘军伟朱会调

天津农业科学 2019年10期

刘丽高登涛魏志峰郭俊英李秋利刘军伟朱会调

摘要：为研究树莓的工厂化育苗技术，提高树莓育苗质量和效率，以树莓品种‘海尔特兹带腋芽的莖段为试验材料，通过对其腋芽初代培养、茎段增殖、叶柄不定芽和根的诱导等过程中植物生长物质合理组合，及防止茎段褐化的最适pH值进行筛选，建立‘海尔特兹树莓组织培养及其叶柄再生体系。结果表明，腋芽诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;茎段最佳增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，pH值为5.70，增殖系数为5.0;诱导叶柄产生愈伤组织再生不定芽的最佳培养基为MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA，其愈伤组织诱导率为100%，不定芽再生率为53%;幼苗最佳生根培养基为 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率达95%。

关键词：树莓;‘海尔特兹;叶柄;愈伤组织

中图分类号：Q813.1+2;S663.2 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.005

Abstract：In order to improve the quality and efficiency of industrial seedling cultivation of raspberry， stem segments with axillary buds of the raspberry cultivar 'Heritage' were used as experiment material， the regeneration system of leaf petioles was established through screening of the reasonable plant growth substances combination in the process of axillary bud primary culture， stem segment proliferation， petiole adventitious bud and root induction， and the optimum pH value to prevent stem segment browning. The results showed that the optimum medium for axillary bud induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA， and the germination rate was 100%; the optimum medium for stem segment proliferation was MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA， and the pH value was 5.70， which the multiplication coefficient was 5.0; the optimum medium for petiole callus regeneration was MS+2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA， which the induction rate of callus was 100%， and the regeneration rate of adventitious bud was 53%; the optimum medium for rooting was 1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA， and the rooting rate was 95%.

Key words： raspberry; 'Heritage'; petiole; callus

树莓（Rubus idaeus）是蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L.）多年生落叶灌木型果树，其果实营养丰富，除含有丰富的有机酸、氨基酸和维生素外，还含有鞣化酸、黄酮类物质和SOD等，具有很好的保健功能，被称为“第三代水果”[1-5]。近几年，我国树莓发展呈逐年增长趋势，其生产量由2012年的1万t发展到2015年的2.5万t[6]。

‘海尔特兹是引自美国纽约州的双季树莓品种，果实口味独特，品质优良，色泽鲜艳，营养丰富，硬度大，抗病虫能力强，栽培容易，管理简单，经济效益显著[7-8]，是目前市场上推广相对较多的一个品种。

目前，我国树莓种苗繁殖生产上多采用根蘖、扦插、压条等技术，不仅苗木繁殖系数低、易受季节影响，同时易积累病毒，导致品质变劣、产量下降，造成生产上重大的经济损失[9-10]。国外的树莓生产上多采用组培苗甚至脱毒苗建园，组培苗根系发达、生长健壮，连续产量高，无病虫害等优点，有利于树莓产业的健康发展。

本试验对‘海尔特兹树莓组培及其叶柄再生体系建立的条件进行探讨和优化，为建立工厂化育苗体系及进一步的倍性育种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试树莓品种为‘海尔特兹，2015年栽种于中国农业科学院小浆果种质资源圃，于2018年春季剪取其新萌发枝条装入冰盒带回实验室。

1.2 方法

试验所用MS培养基均由30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1琼脂组成。

1.2.1 消毒灭菌截取‘海尔特兹树莓新发枝条上端15 cm，剪去叶片，用洗洁精洗净，在流水下冲洗2～3 h;在超净工作台上，将茎段在75%酒精中消毒30 s，再置于0.1%升汞中消毒5 min，无菌水冲洗4～5次，放在滤纸上，将材料剪成1 cm左右带芽茎段（芽下部茎稍长些）供接种使用。

1.2.2 初代培养将接种茎段分别接种于含不同植物生长物质的MS培养基中，pH值为5.80。植物生长调节物质设4个处理：1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IAA;每个处理10瓶，每瓶接种3个外植体。接种30 d后调查腋芽萌芽情况，统计萌发率。

1.2.3 防褐化处理将经过初代培养产生的茎段分别接种于不同pH值的MS培养基中，设3个处理，pH值分别为5.80，5.75，5.70。每个处理10瓶，每瓶接种3个外植体。接种15 d后调查褐化情况，统计褐化率。1.2.4 茎段增殖经初代培养产生的茎段，需进行增殖培养。将萌发后的幼嫩无菌苗剪取成1～2 cm转移到添加不同植物生长物质的MS培养基中，pH值为5.70，植物生长调节物质设8个处理：1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 NAA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.1g·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA;0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 IBA。每个处理10瓶，每瓶3株无菌苗，培养30 d后观察不定芽分化和生长情况，计算增殖系数。

1.2.5 叶柄不定芽诱导经过初代培养萌发的腋芽长至3 cm左右，在无菌工作台上取下叶柄，叶柄剪至0.5 cm长，分别接种于6种添加不同植物生长物质的MS培养基中，pH值为5.80。植物生长物质设6个处理：2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 IAA;2.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA;2.0 mg·L-1 TDZ+0.5mg·L-1 IBA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IAA;1.0 mg·L-1 TDZ+1.0 mg·L-1 IBA。每个处理6瓶，每瓶放置5个剪好的叶柄。培养40 d后观察愈伤形成和出芽生长情况。

1.2.6 根的诱导以1/2 MS培养基为基本培养基，pH值为5.80。将诱导产生的>2 cm的不定芽接种于培养基中，培养基共设计3种不同浓度的IBA组合，分别为1.0，0.7，0.5 mg·L-1。每个处理10瓶，每瓶接种3株不定芽，培养30 d后观察并记录生根情况。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel2007对数据进行计算分析。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长物质组合对‘海尔特兹腋芽出芽的影响

‘海尔特兹树莓茎段初代培养效果详见图1和表1。由表1可知，当初代培养MS中6-BA为1.0 mg·L-1时，‘海尔特兹树莓茎段萌芽率随着NAA和IAA浓度的增加而增加，以1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 IAA浓度的植物生长物质组合效果最佳，萌芽率可达到100%。

2.2 不同pH值对茎段褐化率的影响

由表2可知，经过初代培养萌芽的腋芽接种在不同pH值MS培养基中均出现不同程度褐化，其褐化率随着pH值的降低而降低，在pH值为5.70的MS培养基中褐化率最低，为16.7%。

2.3 不同植物生长物质组合对‘海尔特兹茎段增殖的影响

由表3可知，在8個不同生长物质组合中，‘海尔特兹茎段的增殖培养效果以0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA组合处理最好，其增殖系数为5.0。

2.4 不同植物生长物质组合对‘海尔特兹叶柄愈伤组织诱导和不定芽形成的影响

叶柄在愈伤组织诱导培养基中两端逐渐膨大（图2），不同植物生长物质组合处理均可产生愈伤（图3），即各处理愈伤组织诱导率均为100%（表4），但有些处理叶柄膨大成愈伤组织后逐渐变褐不能产生再生芽，故各处理不定芽（图4）再生率不同，6个含有不同浓度的植物生长物质组合处理中，以2.0 mg·L-1TDZ +1.0 mg·L-1IBA处理愈伤组织不定芽再生率最高，为53%（表4）。

2.5 不同浓度的植物生长物质对‘海尔特兹幼苗生根的影响

将生长至2～3 cm的健壮幼苗剪下接种到生根培养基中，生根效果良好（图5）。由表5可知，随着培养基中IBA浓度的增加，‘海尔特兹幼苗生根率呈先升后降的趋势，在IBA为0.7 mg·L-1时生根率最高，达到95%。

3 结论与讨论

褐化、菌类污染和玻璃化现象一直是组织培养中的难题[9]。褐化是由于酚类物质被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌类物质，抑制了相关酶的活性，从而阻碍培养材料的正常生长，甚至导致培养物死亡[10]。配制培养基时，适当地降低pH值可以降低多酚氧化酶活性和底物利用率，进而抑制褐变，升高pH值则明显加重褐变[11]。金坚敏[12]在水稻的体细胞培养过程中发现，pH值为 4.5～5.0 的MS培养基可使愈伤组织保持良好的生长状态，而pH值为5.5～6.0时，愈伤组织发生严重褐化。在本试验中，‘海尔特兹的增殖培养过程中褐化率随着培养基pH值的降低而降低，当pH值为5.70时，其褐化率为16.7%，褐化问题得到有效缓解，而有关pH值继续降低是否有助于其褐化率进一步降低的问题尚需讨论，但在本试验中因培养基pH值低于5.70时不易凝固，故pH值最低定为5.70。

李艳霞[13]以树莓品种‘波鲁德茎尖为材料，茎尖诱导最佳培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.5 mg·L-1 GA3，建立了离体培养再生体系。潘菊等[14]以带腋芽茎段为外植体，研究了树莓的组织培养与快速繁殖技术，得出树莓的最佳诱导培养基为MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA;最佳增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA;最佳生根培养基为1/2MS+0.05 mg·L-1NAA+20 g·L-1白糖。本试验侧重于对叶柄进行再生培养，建立了‘海尔特兹完善的组培再生体系，为工厂化育苗和在组培再生基础上的倍性育种奠定了基础，其腋芽诱导最佳培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA +1.0 mg·L-1 IAA，萌芽率100%;茎段最佳增殖培养基为MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，增殖系数为5.0;诱导叶柄产生愈伤组织再生不定芽的最佳培养基为MS+2.0 mg·L-1 TDZ +1.0 mg·L-1 IBA ，其愈伤组织诱导率为100%，不定芽再生率为53%;幼苗最佳生根培养基为1/2 MS+0.7 mg·L-1 IBA，生根率达95%。

参考文献：

[1]赵利群，王晓冬，李长海.9个树莓栽培品种营养成分分析[J].防护林科技，2015（6）：57-59.

[2]张般般，刘婷，杨静慧，等.4个树莓品种茎解剖结构与抗旱性的关系[J].西南大学学报（自然科学版），2018，40（5）：53-58.

[3]郭玉霞，董彦琪，刘喜存，等.红树莓组培快繁技术研究[J].河南农业科学，2011，40（4）：127-128，133.

[4]陈双建，郜敏，温福喜，等.树莓多倍体诱导试验初报[J].山西农业科学，2011，39（11）：1143-1145.

[5]张林水，李志民，李波，等.树莓组培快繁技术体系研究[J].山西农业科学，2006（1）：32-34.

[6]李亚东.中国小浆果产业发展报告[M].北京：中国农业出版社，2016：29-34.

[7]王伟.树莓高产栽培技術[J].北方园艺，2009（6）：151.

[8]董敬超.海尔特兹树莓组培苗温室驯化移栽技术研究[J].农业科技通讯，2015（7）：139-140.

[9]郭艳，杨海玲.植物组织培养中的褐化现象及解决途径[J].山西农业科学，2009，37（7）：14-16，31 .

[10]曹慧，薛佳桢，孙京波.树莓组织培养技术的研究[J].北方园艺，2010（22）：125-127.

[11]尹相博，于咏梅，于立芝.红树莓组织培养研究进展[J].黑龙江农业科学，2013（2）：140-143.