张振 郜文辉 田雪飞 陈思勤 何凤姣 周芳 王亚琪 朱洪兵 李克雄 曾普华

摘要：目的  观察益气化瘀解毒方对人肝癌细胞SMCC-7721自噬流的影响，初步探讨其可能的作用机制。方法  实验分为空白对照组、重楼皂苷Ⅰ组、益气化瘀解毒方组、雷帕霉素组及索拉非尼组，各给药组给予相应药物。体外实验观察人肝癌细胞SMCC-7721自噬流发生情况并检测细胞微管相关蛋白1轻链3（LC-3Ⅱ）、类胰岛素样生长因子2的mRNA结合蛋白质（p62）及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达。结果  重楼皂苷Ⅰ、益气化瘀解毒方及索拉非尼均能阻断人肝癌细胞SMCC-7721自噬流，导致细胞内自噬小体的蓄积，上调LC-3Ⅱ、p62的表达，同时可下调PI3K、mTOR蛋白的表达。结论  益气化瘀解毒方可改变人肝癌细胞SMCC-7721形态;重楼皂苷Ⅰ、益气化瘀解毒方及索拉非尼均能阻断人肝癌细胞SMCC-7721自噬流，增加自噬体数量，其机制可能与抑制PI3K/mTOR信号通路有关。

关键词：益气化瘀解毒方;自噬流;人肝癌细胞SMCC-7721

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）10-0045-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.011      开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721; To preliminarily discuss its possible mechanism of action. Methods The experiment was divided into blank control group， Chonglou saponin Ⅰ group， Yiqi Huayu Jiedu Prescription group， Rapamycin group and Sorafenib group. Each administration group was given relevant medicine. In vitro experiments were performed to observe the occurrence of autophagy flow in human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721 and to detect the expressions of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC-3Ⅱ）， insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein （p62） and phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K）， mammalian target of Rapamycin （mTOR）. Results Chonglou Saponins Ⅰ， Yiqi Huayu Jiedu Prescription and Sorafenib could block the autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721， leading to the accumulation of autophagic bodies in cells and up-regulating the expression of LC-3Ⅱ and p62. The expressions of PI3K and mTOR protein could be down-regulated. Conclusion Yiqi Huayu Jiedu Prescription can change cell morphology of SMCC-7721; Chonglou saponins Ⅰ， Yiqi Huayu Jiedu Prescription， and sorafenib can block the autophagy flow of SMCC-7721 and increase the number of autophagic bodies， which may be related to the PI3K/mTOR signal pathway.

Keywords： Yiqi Huayu Jiedu Prescription; autophagy flow; human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721

據统计，原发性肝癌发病率在恶性肿瘤中居第6位，死亡率居第4位，我国肝癌患者死亡人数占全球一半以上[1]。中医药资源丰富，是治疗原发性肝癌的手段之一，长期服用毒副作用低[2]。有研究表明，中药在抑制血管新生、抗凋亡、调节免疫及改善生活质量等方面发挥了重要的作用[3-4]。益气化瘀解毒方是全国名中医潘敏求教授治疗肝癌效验方。我们前期研究发现，其可下调人肝癌细胞CXCL12/CXCR4/ CXCR7趋化因子轴，抑制细胞增殖及迁移，同时能降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度（MVD），抑制低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而发挥抗肿瘤作用[5-10]。下调HIF-1α能通过多种途径促进VEGF的表达，VEGF是PI3K/mTOR信号通路上游的关键靶点之一，且PI3K/mTOR信号通路是参与细胞自噬的经典途径之一。因此，在前期实验的基础上，本研究以PI3K/mTOR信号通路介导肝癌细胞自噬性死亡为可能机制，进一步探讨益气化瘀解毒方抗肿瘤的作用途径，为开发抗肝癌多靶点的中药新药提供依据。

1  实验材料

1.1  细胞

人肝癌细胞SMCC-7721，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2  药物

益气化瘀解毒方（黄芪30 g，白参10 g，半枝莲 30 g，醋莪术15 g，甘草5 g），饮片均购自湖南中医药大学附属第一医院中药房;索拉非尼，南通飞宇生物科技有限公司，批号FY34720409，20 mg/支，含量≥98%;重楼皂苷Ⅰ，南通飞宇生物科技有限公司，批号FY11010222，50 mg/支，含量≥98%;雷帕霉素，南通飞宇生物科技有限公司，批号FY3415RKR089，20 mg/支，含量≥98%。

1.3  主要试剂与仪器

双抗（青霉素-链霉素）、胎牛血清、PBS、DMEM和胰蛋白酶，Gibco公司;细胞冻存液，天津灏洋;mGFP-RFP-LC3（LC3自噬双标腺病毒），汉恒生物;一抗，Abcam公司;BSA，华美公司;PVDF膜，Amersham公司，HRP偶联山羊抗鼠、兔IgG，Sigma公司。0.22 mm移液枪（Gilson），细菌滤器（Millipore），无菌盒装吸头（Axygen），一次性离心管（Corning），细胞培养皿（Nest biotechology），细胞培养板（Costar），巴氏吸管（武汉博士德），氨基载玻片（天津灏洋），爬片（SORFA），培养瓶（Corning），超净工作台（SW-CJ-1FD，苏州苏洁净化设备有限公司），离心机（TD5A，长沙英泰仪器有限公司），倒置显微镜（XDS-1B，重庆光电北京有限公司），恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司），水浴箱（上海一恒科技有限公司），共聚焦显微镜（FV1000，日本Olympus）。

2  实验方法

2.1  细胞培养

将人肝癌细胞SMCC-7721接种于高糖培养液中（含10%胎牛血清），置于90%N2-5%CO2-5%O2培养箱培养。

2.2  药物制备

将益气化瘀解毒方饮片煎煮并浓缩至每1 mL含1 g原药材，滤纸粗滤，将药物按一定比例配制成含中药的DMEM溶液。使用前将药液分别稀释至5 g/L。重楼皂苷Ⅰ：将50 mg样品溶于0.25 mL DMSO中配制成母液，并将母液溶于DMEM，配制成50 mg/L。索拉非尼：將200 mg样品溶于DMSO，再将溶有索拉非尼的DMSO溶于DMEM，配制成6 μmol/L溶液。雷帕霉素：将20 mg雷帕霉素溶于DMSO，再将溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM，配制成4 μmol/L溶液。

2.3  分组和给药

实验分为益气化瘀解毒方组、重楼皂苷Ⅰ组、雷帕霉素组、索拉非尼组和空白对照组。每孔加入已配制好的药液2 mL，干预24 h。

2.4  免疫荧光检测

取贴壁对数生长期的细胞，加入配制好的腺病毒（1 μL腺病毒∶1 mL DMEM）1 mL，置于培养箱中培养6 h后加入药物干预，24 h后，加入预冷多聚甲醛2 mL，室温静置10 min;用吸水纸吸干，滴入荧光淬灭剂封片，在荧光共聚焦显微镜下观察。

2.5  Western blot检测

取5×104/mL对数生长期细胞2 mL接种至6孔板，药物干预24 h后，根据RIPA蛋白抽提试剂说明提取各组蛋白，BCA法测定各组细胞总蛋白，各组取等量蛋白。然后按样品∶上样缓冲液=4∶1比例加入上样缓冲液并混合均匀，100 ℃水浴10 min，之后置于冰上5 min，加入上样缓冲液煮沸3 min，经SDS-PAGE电泳，转膜，加一抗稀释液（LC3、p62、PI3K、mTOR）并将二抗稀释至1∶3000，室温孵育1 h，洗膜，化学发光法，曝光，显影，定影，拍照。用Image J进行灰度分析，并以β-actin作为内参。实验独立重复3次。

3  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以 —x±s表示，多组均数间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  益气化瘀解毒方对人肝癌细胞SMCC-7721自噬流的影响

共聚焦显微镜下自噬小体显示为红色荧光蛋白（RFP）与绿色荧光蛋白（GFP）merge后的黄色荧光。由于GFP遇酸会发生淬灭，因此，自噬溶酶体在荧光显微镜下显示为红色斑点。与空白对照组比较，益气化瘀解毒方组、重楼皂苷Ⅰ组及索拉非尼组人肝癌细胞SMCC-7721细胞自噬流均明显受阻，导致细胞自噬小体蓄积，益气化瘀解毒方组与重楼皂苷Ⅰ组比较差异无统计学意义（P>0.05），但与索拉非尼组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、表1。

4.2  益气化瘀解毒方对人肝癌细胞SMCC-7721自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p62蛋白表达的影响

与空白对照组比较，重楼皂苷Ⅰ组、益气化瘀解毒方组及索拉非尼组均能上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p62的表达，差异有统计学意义（P<0.05）;与雷帕霉素组比较，重楼皂苷Ⅰ组、益气化瘀解毒方组及索拉非尼组均能下调自噬相关蛋白LC3Ⅱ及p62的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2、图3。

4.3  益气化瘀解毒方对人肝癌细胞SMCC-7721自噬相关通路PI3K/mTOR蛋白表达的影响

与空白对照组比较，重楼皂苷Ⅰ组、益气化瘀解毒方组和索拉非尼组均能下调PI3K、mTOR的表达，差异有统计学意义（P<0.05）;与雷帕霉素组比较，重楼皂苷Ⅰ组、益气化瘀解毒方组和索拉非尼组均能上调PI3K、mTOR的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4、图5。

5  讨论

全国名老中医潘敏求教授结合其多年临床经验，将肝癌病因病机总结归纳为“虚”“毒”“瘀”：肝癌患者常见脘腹胀满、神疲乏力、消瘦、纳呆、大便溏结等为“脾虚”之症;肝癌病情复杂、发展变化快、预后差，常合并肝炎、肝硬化等病史，同时多种病理因素夹杂，这些均属中医学“毒”或“癌毒”范畴;肝癌常见的上腹肿块及肝区固定疼痛等，是“瘀”的客观表现。癌乃“因虚致癌”，先有正气不足，而后受外来“邪毒”侵袭，导致毒瘀互结而成，癌变进一步发展使正气更虚，从而又表现出“因癌致虚”的现象，血瘀、邪毒、正气虚三者始终并存，互为因果，恶性循环，贯穿于肝癌整个病程。潘老在此基础上提出，“健脾理气、化瘀软坚、清热解毒”为肝癌基本治法，并拟定益气化瘀解毒方为治疗肝癌基础方。方中重用黄芪、白参，取其健脾益气、扶正固表之功，并以醋莪术化瘀止痛，半枝莲清热解毒，甘草调和诸药，全方共奏益气化瘀、清热解毒之效。

自噬是一把双刃剑，根据细胞环境和功能状态的不同，自噬可提高细胞活力，或诱导细胞程序性死亡[11]。细胞自噬是一个动态过程，自噬体形成增加及自噬溶酶体降解过程被阻断，均可使自噬小体蓄积，导致细胞死亡[12]。LC3是一种泛素样蛋白，与自噬体的表达有密切关系，在细胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ形式存在，其中LC3Ⅱ主要存在于自噬体膜上，而LC3Ⅰ定位于细胞质中。LC3Ⅱ对于自噬体的形成起决定性作用，细胞去除LC3Ⅱ后，无法形成完整的自噬小体。而且LC3Ⅱ表达的多少与自噬体数量呈一一对应关系，因而成为应用最为广泛的细胞自噬体标记物之一。LC3Ⅱ的高表达表明自噬小体数量的蓄积。p62具有多重作用，在自噬体和溶酶体结合过程中，为溶酶体提供供体，并引导自噬体与溶酶体结合，是自噬体降解过程中的一种选择性底物蛋白。p62的下调表明自噬流被活化，而p62的上调则表明自噬流被阻断。

PI3K/mTOR信号通路是细胞中关键的复兴自噬调节信号通路。有研究表明，PI3K/mTOR信号通路的上调可促进肿瘤的恶化[13]。PI3K是普遍存在于细胞质中的一种蛋白激酶。细胞中的多种生长因子，如HIF-1α，可激活细胞中的酪氨酸激酶，从而激活PI3K。PI3K激活后把PIP2转化为PIP3，PI3P对自噬囊泡的形成起到了至关重要的作用。生成的PIP3作用于下游信号分子蛋白激酶B（Akt），导致Akt构象改变，使Akt激活。Akt激活后可直接激活下游信号分子mTOR。mTOR是PI3K家族中的成员之一，在细胞自噬过程中起着重要作用。

本研究结果表明，重楼皂苷Ⅰ、益气化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制细胞自噬流，导致细胞自噬小体蓄积，使细胞损伤死亡，产生抗肿瘤作用，且益气化瘀解毒方中活性成分可能是重楼皂苷Ⅰ，其机制可能与下调PI3K、mTOR蛋白的表达有关。

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（收稿日期：2019-03-25）

（修回日期：2019-04-16;编辑：华强）