李清琴，董荔红，吴丹梅，钟福春，张 朵

(联勤保障部队第九〇〇医院临床遗传与实验医学科，福建福州 350025)

据统计中国育龄夫妇中受不育不孕困扰的大约有10%～15%，其中男性因素约占50%[1]。精子核DNA完整性，是父源性遗传信息能否准确传递给后代的关键。约20%的特发性不育症存在精子DNA断裂指数(DFI)高[2]。精子DFI高会降低卵母细胞的受精率、胚胎质量及受孕率[3]。精子功能评价除了精液质量分析外，增加精子DNA损伤检测作为一项新指标，可预测自然受孕和体外受精的结局，监测环境污染物和医疗干预诱发的精子DNA损伤，评估男性生殖系统疾病及其相关治疗[4-5]。为探究精子DNA损伤的发病机理，本文综合分析男性不育患者年龄、浓度、活力与精子DFI之间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015-2017年，在联勤保障部队第九〇〇医院生殖中心治疗不育症患者的精液质量参数和精子DFI作为研究对象，年龄分布在20～62岁，平均(32.9±5.3)岁。有正常夫妻生活的育龄夫妇，未采取任何避孕措施，女方1年以上未怀孕，即可诊断为不育症。排除具有以下情况的不育症患者：重度吸烟、男性生殖器官发育缺陷、精索静脉曲张、生殖器官炎性反应、全身性疾病、3个月内服用可能影响精液常规的药物、无精子症等。

1.2方法

1.2.1精液分析 禁欲2～7 d后采集精液标本，37 ℃恒温箱液化15～30 min。充分混匀后，采用手工法进行精液质量分析。所有精液分析均由2名规范化培训合格的技术人员操作完成，两两比对，进行严格的室内质控管理。根据《人类精液检查与处理实验室手册第5版》标准，将精子运动分类为前向运动(PR)、非前向运动(NP)和不活动(IM)的精子。精液特性的部分参考值下限(95%CI)：精子浓度≥15×106/mL;精子总活力(PR+NP)≥40%，PR精子≥32%。根据精子活力(PR级精子比率)的强弱将弱精子症分4类：轻度弱精子症(20%≤PR<32%)、中度弱精子症(10%≤PR<20%)、重度弱精子症(1%≤PR<10%)、极度弱精子症(PR<1%)。

1.2.2精子DFI检测 流式细胞仪-精子染色质结构分析法进行精子DFI检测。具体如下：精液经过低pH值的缓冲液处理后，精子核DNA链在断裂处变性，吖啶橙荧光染色，通过BD FACS CnatoTMⅡ流式细胞仪收集荧光性号，Diva软件进行数据分析。精子DFI值=有碎片化的精子数/被观察的总精子数×100%，其中DFI值≤15%表示精子DNA完整性好；15%

1.2.3分组设计 观察年龄对精子DFI的影响，将弱精子症组(664例)和正常组(455例)根据年龄分为3组，年龄<30岁、年龄30～34岁、年龄>34岁。

1.3统计学处理 用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，选用非参数检验进行组间差异分析，P<0.05表示差异有统计学意义。采用多元线性回归分析DFI与精液参数的相关性。

2 结 果

2.1精子DFI与其他参数之间的相关性 相关性分析结果显示，精子DFI与年龄呈正相关(r=0.172，P<0.001)，与精子活力呈负相关(r=-0.457，P<0.001)，而与精子浓度无相关性。见表1。

表1 精子DFI与其他参数之间的相关性分析

2.2少、弱精子症组和正常组的精子DFI比较 少、弱精子症组的精子DFI分别为(27.2±15.0)%、(27.9±14.4)%，均明显高于正常组的(16.8±8.5)%，差异有统计学意义(P<0.001)。见表2。

表2 少、弱精子症组与正常组的精液质量参数及精子DFI比较

2.3不同程度的弱精子症之间的精子DFI比较 将664例弱精子症患者根据精子活力的强弱分为轻度、中度、重度及极度弱精子症4组，各组的精子DFI均值分别为(20.1±9.6)%、(27.6±13.4)%、(32.8±17.3)%，(40.1±20.2)%，异常率(异常率=DFI值小于30%的检测例数/总检测例数×100%)分别为17.2%、33.0%、51.1%、63.9%，均明显高于正常组的异常率8.1%，尤其是重度和极度弱精子症组。不同精子活力组间的DFI值比较差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

表3 不同程度的弱精子症之间的精子DFI比较

2.4年龄对精子DFI的影响 弱精子症组中，各年龄组间的精子DFI比较差异有统计学意义(P<0.05)，随着年龄增大，精子DFI明显升高。而正常组中，各组间精子DFI比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同年龄组精子DFI比较

3 讨 论

男性生育能力的评估指标主要包括精液质量分析、精浆生化、精子DFI等。虽然精液质量分析被认为是男性生育力的金标准，但是其不能检测精子分子水平的异常。精子DNA损伤影响DNA碱基对的复制与转录，直接导致了遗传信息的缺失并影响生物转化功能，从而阻碍胚胎形成[6]。前期研究显示，当精子DFI超过30%时，自然生育率会大幅降低。

精子DNA损伤的病理生理机制尚未完全清楚，已报道的影响精子DFI的因素主要包括：(1)精子发生和成熟功能障碍如组蛋白-鱼精蛋白转换故障导致染色质包装异常；(2)男性生殖系统疾病或全身性疾病如炎性反应、糖尿病、精索静脉曲张、恶性肿瘤等；(3)生活方式包括吸烟、喝酒、饮食等；(4)环境因素如接触紫外线、电离辐射、有毒化学物质等；(5)其他因素，如年龄、禁欲时间、季节等[7-9]。

相关研究表明年龄增长，男性生育力下降、精液参数变差包括精子活动力降低、精子DNA损伤升高和精子形态异常率升高[10-11]。这可能因为年龄增加，活性氧(ROS)积累，高水平的ROS促进氧化应激，诱导脂质过氧化和进一步产生ROS，导致细胞凋亡或对DNA的氧化损伤[12]。与国内外报道一致，本研究也发现年龄与精子DFI呈正相关。本研究还发现弱精子症组中，年龄>34岁的精子DFI显著高于年轻≤34岁男性，>34岁组的异常率为40.9%，30～34岁组的异常率为32.5%、<30岁组的异常率为23.4%。而正常组中，年龄差异无统计学意义。

另一方面，男性不育中弱精子症大约占19%，其特征是精子活力降低或无活力。精子运动的影响因素包括遗传性疾病(内脏逆位-鼻窦炎-支气管扩张综合征、囊性纤维化)，代谢和结构综合征(线粒体和鞭毛缺乏)，细胞凋亡等[13]。本研究发现与正常组相比，精子DFI在弱精子症患者中明显升高，异常率高于正常组，尤其是重度和极度弱精子症组，其升高水平与精子活力下降的程度有明显的相关性。这可能是由于精子膜内含有较高浓度的不饱和脂肪酸，过量ROS会诱导其发生脂质过氧化，使精子膜的流动性和完整性受到损伤，导致精子线粒体、精子核内DNA受损。高水平的ROS释放到细胞质中，减少了精子活力的能量供应，使精子活力降低，细胞凋亡，进而导致男性不育。MAHFOUZ等[14]发现精液中ROS水平增加25%，精子DFI大约会增加10%，精子活力大幅度下降。SHI[15]等研究也发现ROS水平增加，可能诱导精子氧化损伤，精子功能受损，精子活力可能是这种损伤最早和最敏感的指标之一。因此，笔者认为某些因素如过量ROS水平等会同时影响精子DNA损伤与精子活力。

综上所述，精子DFI与精子活力呈负相关，且升高水平与精子活力的下降程度有关，提示精子DNA损伤可能存在与精子活力下降相同的影响机制。本研究还发现在弱精子症患者中，精子DFI与年龄呈正相关，>34岁组中精子DFI显著高于≤34岁组，提示年龄也是阻碍弱精子症患者获取孩子的不利因素之一。因此，男性不育患者应正视并及早就医。