李佳秀，张春岭，刘慧，陈大磊，刘杰超，焦中高

（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

蓝莓，又名蓝浆果、越橘，为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）植物，其果实富含糖、有机酸、维生素、氨基酸、微量元素和花青素、酚酸类等生物活性成分，具有改善视力、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗糖尿病、降血脂、降血压、保护神经细胞等功效，可预防癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经系统退行性疾病等多种慢性疾病的发生和发展[1-3]，因此深受消费者喜爱。但由于蓝莓成熟期正值夏季，且生产时间集中，果实不耐贮运，易造成积压、腐烂，严重影响市场供应和产业发展[4-5]。将蓝莓加工成果汁、果酒、果酱等产品，不仅可满足人们美好生活和健康饮食的需要，而且延伸了蓝莓产业链条，有助于减少蓝莓采后损失，保障蓝莓产业健康发展。其中，蓝莓果汁由于酸甜适口、营养丰富而深受市场欢迎，成为蓝莓加工的主导产品[6-7]。然而，由于蓝莓原料价格较高，供应受限，使得蓝莓果汁极易成为掺假的对象，因此迫切需要建立准确度高、适用性广的蓝莓果汁掺假鉴定方法，以维护消费者利益和身体健康以及蓝莓果汁行业正常生产秩序，保障蓝莓果汁行业健康发展。

当前用于果汁掺假鉴定的方法主要有感官分析法、特征性成分分析法以及分子生物学方法等[8-10]。如：Tezcan 等[11]通过比较石榴汁与苹果汁的氨基酸组成发现L-天冬酰胺可以作为鉴别石榴汁中掺假苹果汁的特征成分；Nuncio-Jáuregui 等[12]通过测定样品中的脯氨酸、酒石酸、蔗糖含量以及挥发性成分来鉴定石榴汁中掺入葡萄汁或桃汁；Zhang 等[13]根据不同果汁中黄酮类、花色苷类等特征性物质的差别利用代谢组学方法可实现对蓝莓汁、蔓越莓汁及掺加苹果汁、葡萄汁的伪品进行鉴别；单核苷酸多态性实时荧光定量核酸扩增技术可用于橙汁中掺假柑橘汁的鉴别[14]。这些方法多基于一些特定的掺假行为或产品，识别方式单一，应用范围有限，因此，建立简单易行、适用性广泛、结果可靠的非靶向果汁鉴伪方法显得尤为迫切。

指纹图谱技术是一种从整体上研究复杂物质体系的非靶向化学分析方法，具有整体性和模糊性的特点，广泛应用于中草药及其制剂的质量分析与控制[15]。近年来随着技术的发展，指纹图谱在食品掺假鉴定中也得到了较多的研究和应用[16-18]。如：喻凤香等[19]采用气相色谱法建立了米糠油的脂肪酸指纹图谱，通过相似度分析可实现掺伪量16%以上的米糠油的定量判断；胡明华等[20]利用硫酸水解及柱前衍生化高效液相色谱法分析得到可可粉多糖组分的指纹图谱，结合系统聚类分析可实现掺加15%及以上可可壳的可可粉的鉴别；Tian 等[21]采用气相色谱-质谱方法建立了小白杏杏仁油的脂肪酸指纹图谱，并成功应用于掺假鉴定；孙亚娟等[22]采用顶空固相微萃取和气相色谱技术建立杏仁油挥发性成分指纹图谱，可用于菜籽油掺伪量15%以上杏仁油的鉴别；李宝丽等[23]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术建立预包装纯葡萄汁的香气成分的气相色谱-质谱指纹图谱，结合化学计量学分析能准确将预包装混合果汁、葡萄汁饮料和纯葡萄汁鉴别区分；楚刚辉等[24]采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱结合主成分分析和聚类分析对喀什树莓果汁与市售其他果汁进行区分。但应用指纹图谱技术鉴别果汁的掺假还很少见。前期研究发现，不同种类果汁的有机酸组成存在着较大差异，可以根据果汁中主要有机酸的组成特征来鉴别果汁类型和控制果汁质量[25]。本研究在此基础上，采用HPLC 法对不同产地、不同品种的10 个蓝莓果汁的有机酸组成进行分析，构建蓝莓果汁有机酸的HPLC 指纹图谱，并通过相似度评价、主成分分析和聚类分析，对模拟在蓝莓果汁中添加低价果汁（梨汁、苹果汁、杏汁和桃汁）和外源柠檬酸等掺假方式进行鉴别，以期为蓝莓果汁的掺假鉴定和质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果实分别采自江苏连云港和山东临沂，各5个品种，采收后立即运抵实验室，剔除病虫害果、腐烂果，选取大小、着色基本一致的果实供制汁用。供试蓝莓品种、产地及果汁样品编号见表1。

表1 供试蓝莓果汁样品及编号Table 1 Samples and numbers of tested blueberry juices

草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸标准品：美国sigma 公司；磷酸（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；磷酸氢二铵（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

1525 高效液相色谱仪（配有2707 自动进样器，2998 二极管阵列检测器）：美国Waters 公司；JYLC52V 九阳料理机：九阳股份有限公司；1000 mL 砂芯过滤装置：津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓果汁制备工艺

蓝莓果实→打浆→灭酶（沸水浴，5 min）→冷却→加果胶酶酶解（0.1%，50 ℃，40 min）→冷却→离心→过滤→蓝莓果汁

制得的蓝莓果汁贮存于-80 ℃超低温冰箱，分析前取出2 mL 加水定容至10 mL，用0.22 μm 微孔滤膜过滤。

1.3.2 果汁掺假样品

掺加低价果汁：蓝莓汁中分别掺加20 %、40 %、60%、80%、100%的梨汁、苹果汁、桃汁和杏汁作为伪品，若掺加量为20%时用相似度评价仍能鉴别出伪品，将掺加量降至10%。

掺加外源酸：在原果汁含量为20%的蓝莓汁中掺假柠檬酸作为伪品，柠檬酸掺加量为果汁总重量的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%共 5 个梯度，供试掺假样品及编号见表2。

表2 供试掺假样品及编号Table 2 Numbers of tested adulterate samples

1.3.3 色谱条件

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 精密度试验

取同一蓝莓果汁样品，按1.3.3 色谱条件连续测定5 次，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 稳定性试验

取同一蓝莓果汁样品，按1.3.3 色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 测定，计算各共有峰的保留时间和峰面积的RSD。

1.3.4.3 重复性试验

取同一蓝莓果汁样品，平行制备5 份供试样品溶液，按1.3.3 色谱条件分别进样测定，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

1.3.5 数据处理

采用Microsoft Excel 处理试验数据，将HPLC 图谱数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件，构建对照指纹图谱，并采用夹角余弦法进行相似度评价。

用SAS9.3 统计分析软件进行聚类分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 指纹图谱方法学考察

采用1.3.3 所述色谱条件，蓝莓果汁样品连续测定5 次，各共有峰保留时间和峰面积的RSD 分别小于0.36%和2.84%，说明该方法具有较高的精密度。同一样品在24 h 内的6 次测定结果中，各共有峰保留时间和峰面积的RSD 分别为0.08 %～2.00 %和1.66 %～2.41%，说明该方法在24 h 内稳定性良好。同时，重复性试验结果显示，各共有峰保留时间和峰面积的RSD分别为0.05%～0.48%和2.71%～3.07%，表明该方法具有较好的重复性。

2.2 指纹图谱共有模式的建立及相似度评价

2.2.1 样品图谱的采集

所有蓝莓果汁样品按1.3.3 色谱条件分别进样分析，得到不同蓝莓果汁样品的HPLC 图谱，见图1。

图1 蓝莓汁HPLC 指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of blueberry juices

2.2.2 指纹图谱共有模式的建立及共有峰的标定

将10 个蓝莓果汁样品的HPLC 图谱数据文件导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”，通过设置参照图谱、多点校正、色谱峰匹配、生成对照4 个步骤，得到10 个蓝莓果汁指纹图谱的共有模式（即对照指纹图谱）。图1 中R 为生成的对照指纹图谱，共标定了13 个共有峰。在1.3.3 色谱条件下，将草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸及其混合标准品依次进样，根据保留时间将标准品溶液的色谱图与样品色谱图进行对比，共指认出了5 个共有峰，其中3 号峰为奎宁酸、4 号峰为苹果酸、5 号峰为莽草酸、7 号峰为柠檬酸、8 号峰为富马酸。

2.2.3 共有峰的相对保留时间和相对峰面积

参照峰的确定是建立指纹图谱的关键，通常选取分离度较好、峰位居中、峰面积较大且稳定的色谱峰为参照峰[23，26]。通过比较10 个蓝莓果汁的色谱图，发现7 号峰（柠檬酸）分离度好、比较稳定，峰面积也较大，因此选取7 号峰作为参照峰，其保留时间和峰面积计为“1”，计算其余共有峰的相对保留时间的平均值和相对峰面积值，结果见表3。

从表3 可以看出，10 个蓝莓果汁样品的共有峰的相对峰面积差别较大，13 个共有峰的RSD 在18.99%～64.97%之间，这说明10 个蓝莓果汁的主要特征成分含量差别较大，不同品种、不同产地的蓝莓果汁的指纹图谱存在一定的差异。

表3 10 个样品13 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积Table 3 Relative retention time and relative peak area of 13 common peaks for 10 samples

2.2.4 相似度评价

运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”对10 个蓝莓果汁样品色谱图及对照指纹图谱R 进行相似度评价，结果见表4。

从相似度评价结果可以看出，所有蓝莓果汁之间的相似度均在0.950 以上，10 个样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均在0.978 以上。说明不同品种、不同产地蓝莓果汁的有机酸HPLC 指纹图谱具有较好的一致性，本研究建立的蓝莓汁对照指纹图谱和标定的13 个共有峰可以反映蓝莓果汁的有机酸指纹特征，具有鉴定评价意义。

表4 蓝莓果汁样品与对照指纹图谱的相似度Table 4 Similarities between fingerprint of blueberry juice samples and reference

在指纹图谱应用于真伪鉴定的评价中，通常采用不同样品与对照指纹图谱相似度的平均值或最小值作为阈值[27-28]。在本研究中，10 个不同蓝莓果汁样品与对照指纹图谱的相似度均在0.978 以上，因此可初步确定0.978 为蓝莓果汁的相似度阈值，相似度低于0.978 则可能是掺假蓝莓果汁。

2.3 掺假样品的鉴别

蓝莓果汁按1.3.2 掺假方法处理后，按1.3.3 色谱条件进样分析，得到27 种掺假样品的色谱图。应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件将掺假样品的指纹图谱与蓝莓果汁对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表5。

由表5 可以看出，随着低价果汁和柠檬酸掺加量的增加，掺假样品的指纹图谱与蓝莓果汁对照指纹图谱的相似度逐渐降低。当梨汁与苹果汁的掺加量达到40%，杏汁和桃汁的掺加量达到20%时，掺假样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度低于蓝莓果汁的相似度阈值0.978，此时掺假样品与蓝莓果汁可以区分开。同时由表5 还可以看出，当柠檬酸的掺加量≥0.15%时，掺假果汁样品与对照指纹图谱的相似度即低于蓝莓果汁的相似度阈值0.978，从而可以鉴别出来。

表5 掺假样品与蓝莓果汁对照指纹图谱的相似度Table 5 Similarities between fingerprint of adulterate samples and reference

2.4 化学计量学分析

2.4.1 主成分分析

以10 个蓝莓样品和27 种掺假样品为研究对象，以每个样品的指纹图谱中各色谱峰面积组成原始数据矩阵，用SAS9.3 统计分析软件进行主成分分析，结果见表6 和图2。

表6 主成分的特征值及其贡献率Table 6 Eigenvalues，proportion and cumulative proportion of principal components

续表6 主成分的特征值及其贡献率Continue table 6 Eigenvalues，proportion and cumulative proportion of principal components

图2 主成分分析的得分图Fig.2 Score plots obtained from the principal component analysis

由表6 可以看出，根据特征值大于1 提取主成分，共提取了4 个主成分。4 个主成分的累计方差贡献率为87.70%，基本可以反映全部色谱峰数据所具有的信息。从主成分1 和主成分2 的得分图（图2a）中可以看出，所有蓝莓汁都分布在第一主成分的负方向和第二主成分的正方向，掺假梨汁、苹果汁、杏汁、桃汁的伪品随着掺加量的增加，在得分图中的分布也越来越远，从而可实现区分和鉴别。除了掺加20%苹果汁（PW1）、40%苹果汁（PW2）、10%桃汁（TW0）的蓝莓汁伪品外，其余掺加低价果汁的伪品都能与蓝莓汁样品明显区分开来。而在主成分1 和主成分3 的得分图（图2b）中，掺假梨汁和桃汁的所有伪品都可明显区分开来。此外，所有掺加柠檬酸的伪品都能与蓝莓汁完全区分，说明通过主成分分析可以准确地识别掺加柠檬酸的蓝莓果汁。

2.4.2 聚类分析

对10 个蓝莓汁样品和27 种伪品的原始色谱图提取色谱峰数据，获得一个矩阵，运用SAS9.3 统计分析软件进行聚类分析，结果见图3。

图3 蓝莓汁及伪品的聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis dendrogram of blueberry juices and adulterate samples

由图3 可以看出，当欧氏距离为0.8 时，所有研究对象可以聚为两类，掺加柠檬酸的5 种伪品单独聚为一类，其余伪品与所有蓝莓汁样品聚为一类；当欧式距离为0.4 时，所有研究对象可以聚为6 类，掺加柠檬酸的5 种伪品单独聚为一类，掺加杏汁的4 个伪品（XW2、XW3、XW4、XW5）聚为一类，蓝莓汁样品 LM10单独聚为一类，掺加梨汁的5 个伪品（LW1、LW2、LW3、LW4、LW5） 聚为一类，5 个蓝莓汁样品 LM2、LM3、LM4、LM5、LM9 聚为一类，其余蓝莓汁样品与伪品聚为一类；当欧式距离为0.35 时，所有蓝莓汁样品都可以与27 种掺假样品全部区分开。

3 结论

本研究根据蓝莓果汁有机酸的高效液相色谱分析方法，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（V2.0）”软件，建立了蓝莓果汁HPLC 指纹图谱。相似度评价结果表明，10 个蓝莓果汁的有机酸HPLC 指纹图谱间相似度均在0.950 以上，与对照指纹图谱的相似度均在0.978 以上，不同品种、不同产地的蓝莓果汁的指纹图谱具有很好的一致性。蓝莓果汁中添加其他果汁或柠檬酸可导致相似度降低，而且掺假量越大，其指纹图谱与对照指纹图谱之间的差异越大，但掺假量较小的样品仅用相似度评价不能从蓝莓果汁中分辨出来。应用蓝莓果汁有机酸的高效液相色谱指纹图谱结合主成分分析和聚类分析等模式识别方法，可以实现对蓝莓果汁与掺假低价果汁（梨汁、苹果汁、杏汁和桃汁）和外源柠檬酸样品的区分，而且掺假量越大，区分效果越好。因此，有机酸HPLC 指纹图谱结合化学计量学分析，可用于蓝莓果汁掺假鉴定和质量控制。