石艳宾，李文静

（1.天津天狮学院，天津301700；2.天津嘉汇捷瑞医药科技有限公司，天津301800）

金银花（Lonicera japonica）是忍冬初开的花或干燥的花蕾，具有抗病原微生物、抗炎、解热、保肝、降血脂、止血、免疫调节等作用，临床主要用于治疗各种感染、炎症、高血脂、肿瘤放疗等[1-2]。绿原酸是金银花中典型的抗氧化功效成分，有很强的药理活性，对血液系统、消化系统和生殖系统疾病均有显著疗效[3-4]。芦丁是典型黄酮类抗氧化物质，能降低炎症，有抗病毒和抗氧化作用，可用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等疾病[5-6]。刘亚敏等利用正交试验优选山银花绿原酸提取工艺条件，指出山银花绿原酸提取物具有较好的自由基清除能力[7]。Tingting Cui 等[8]应用Box-Behnken 分析萃取温度、乙醇浓度、浸泡时间对金银花绿原酸提取率的影响，优化绿原酸提取条件为提取温度80 ℃、乙醇浓度为70.37%、浸泡时间为9.35 h。蒋美丽等分析超声辅助乙醇提取金银花绿原酸，提出料液比、时间对绿原酸提取率有显著性影响[9]。研究表明[10-12]，黄酮类物质间、多酚类物质间、番茄红素与甘草黄酮、VE间存在一定程度的协同抗氧化作用，但对酚类物质与黄酮类物质间的抗氧化协同作用研究的较少。本文利用响应面软件优化金银花绿原酸超声波辅助法提取工艺条件，评价金银花绿原酸提取物的抗氧化性，分析酚型抗氧化物质绿原酸与黄酮类抗氧化物质芦丁间的协同抗氧化作用，符合复配抗氧化剂的发展趋势，为天然产物的深度开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿原酸标准品（纯度≥98%）、芦丁标准品（纯度≥98%）：中国食品药品检定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：sigma 公司；维生素 C、无水乙醇：分析纯，天津江天化工技术有限公司；金银花（水分含量7 %）：市售。

1.2 仪器与设备

AL204 分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；UV1000 紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；KM-5200DE 超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；TD5K-Ⅲ低速离心机：长沙东旺实验仪器有限公司；XL-60C 赛多利高速万能粉碎机：上海恒科实业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金银花绿原酸的提取工艺

准确称取粉碎处理金银花样品2 g 于250 mL 磨口三角瓶中，加入乙醇溶液进行超声辅助提取。金银花绿原酸提取液离心机转速5 000 r/min 离心处理20 min，倾出上清液用蒸馏水定容至100 mL 容量瓶，摇匀待测。

1.3.2 绿原酸标准曲线的测定

吸取一定量浓度为117 μg/mL 绿原酸标准溶液于25 mL 容量瓶中，配制成浓度依次为 0、4.68、9.36、14.04、18.72、23.40、28.08 μg/mL 绿原酸标准品待测溶液，以零管为空白，在波长328 nm 处测定标准溶液的吸光度值。以绿原酸标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作绿原酸标准曲线，得回归方程y=0.048 0x-0.005 0 和相关系数R2=0.998 9，金银花样品中绿原酸按照下面公式计算。

绿原酸提取率/%=（提取液的浓度×稀释倍数×100/样品质量）×100

1.3.3 单因素试验

准确称取经预处理的金银花粉2 g，置于250 mL磨口三角瓶中，在其他条件相同的情况下，采用不同乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间进行金银花绿原酸超声辅助提取。以金银花绿原酸提取率为考核指标，比较各因素的条件变化对绿原酸提取率的影响，确定各因素的优水平。

1.3.4 响应面试验优化金银花绿原酸的提取工艺

基于金银花绿原酸单因素试验的结果，以乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间为影响因素，以绿原酸提取率为考核指标，应用SAS9.3 软件设计四因素三水平响应面试验，试验因素与水平设计如表1 所示。

表1 绿原酸响应面法提取试验的因素与水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken design of chlorogenic acid

1.3.5 金银花绿原酸、芦丁抗氧化能力的测定

1.3.5.1 金银花绿原酸、芦丁抗氧化能力测定

准确称取23.6 mg DPPH 试剂，用70%甲醇溶液配制成6×10-4（mol/L）DPPH 溶液，作为母液于冰箱冷藏备用。使用时从母液中吸取10 mL，用70%甲醇溶液定容至100 mL 的容量瓶中，作为DPPH 自由基测定的反应试剂[12-13]。将绿原酸提取物、芦丁、VC配制成适宜浓度的待测系列样品溶液，测定DPPH 自由基清除率，并以VC对DPPH 自由基清除效果为对照，评价金银花绿原酸提取物、芦丁的抗氧化活性。分别移取0.6 mL绿原酸提取物、芦丁、VC待测样品溶液于棕色比色管中，加入6×10-5（mol/L）DPPH 甲醇溶液6 mL，混合摇匀、静置反应30 min 后，在517 nm 处测定反应后的吸光度Ar。70%甲醇溶液与DPPH 溶液反应的吸光度为空白对照Ac，绿原酸提取物、芦丁、VC样品溶液与甲醇溶液对应的吸光度为A0，DPPH 自由基清除率计算公式如下：

1.3.5.2 金银花绿原酸、芦丁协同抗氧化能力测定

在金银花绿原酸、芦丁抗氧化能力分析的基础上，将金银花绿原酸提取物与芦丁按1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 体积比进行混合，依据上述试验方法方依次测定A0、Ar、Ac值，计算复配溶液抗氧化协同系数（SE），分析金银花绿原酸与芦丁协同清除DPPH 自由基的效果。抗氧化协同系数SE 为复合溶液测定的清除率（ESC）和理论清除率（TSC）之间的比值。当SE＜1，绿原酸提取物与芦丁间没有明显的协同作用；SE＞1，表示二者间具有协同作用。理论清除能力（TSC）的计算如下：

式中：ESC1为复合溶液中绿原酸的试验测定清除率，%；ESC2为复合溶液中芦丁试验清除率，%。

1.4 试验数据处理方法

单因素试验平行3 次，采用EXCEL 进行单因素试验数据处理，应用SAS.9.3 软件进行优化提取工艺条件及方差分析。

2 结果与分析

2.1 金银花绿原酸提取单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对绿原酸提取率的影响

在料液比 1 ∶20（g/mL）、超声温度 30 ℃、超声时间20 min 的条件下，考察不同提取溶剂乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）对金银花绿原酸提取效果的影响，结果如图1 所示。

图1 乙醇浓度对金银花绿原酸提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由图1 可知，金银花绿原酸的提取率随着乙醇浓度的升高逐渐增加，当乙醇浓度为70%时金银花绿原酸提取率最高。继续增大乙醇溶液浓度，可能是由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，竞争与乙醇、水分子结合，导致绿原酸提取率出现下降现象，故确定金银花绿原酸提取溶剂乙醇浓度为70%。

2.1.2 料液比对绿原酸提取率的影响

在超声温度30 ℃、超声时间20 min、乙醇浓度70 %的条件下，考察料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）对金银花绿原酸提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对金银花绿原酸提取率的影响Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of Lonicera japonica chlorogeni cacid

绿原酸提取率随溶剂体积的增加而增大，当料液比增加至1 ∶20（g/mL）后金银花中绿原酸的提取率达到最大值，随后变化基本趋于不变。提取溶剂量越大，提取效果越好，但过多的提取溶剂使有些难溶出的物质有可能被提取出来，对绿原酸的提取造成干扰，也会对后处理工序造成麻烦及能源浪费。因此，确定料液比 1 ∶20（g/mL）较为适宜。

2.1.3 超声温度对绿原酸提取率的影响

在超声时间 20 min、料液比 1 ∶20（g/mL）、乙醇浓度 70%的条件下，考察超声温度（30、40、50、60、70 ℃）对金银花绿原酸提取率的影响，结果见图3。

图3 超声温度对金银花绿原酸提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

金银花绿原酸提取率在30 ℃至40 ℃时，随温度升高而上升；在40 ℃至70 ℃之间，随着温度的升高绿原酸提取率反而出现下降趋势。提取温度的升高可增大绿原酸的溶出量，但温度过高可能导致绿原酸的结构被破坏，导致提取率降低。因此，金银花绿原酸提取的较适宜温度为40 ℃。

2.1.4 超声时间对绿原酸提取率的影响

在乙醇浓度 70%、料液比 1 ∶20（g/mL）、超声温度40 ℃的条件下，考察超声时间（10、20、30、40、50 min）对金银花绿原酸提取率的影响，结果见图4。

图4 超声时间对金银花绿原酸提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由图4 可知，金银花绿原酸提取率随时间的延长呈现先上升后下降的现象，超声提取20 min 时绿原酸提取率最高。绿原酸提取率在提取时间大于20 min 后出现下降趋势，可能提取时间延长使部分绿原酸结构破坏，从而导致绿原酸提取率降低。因此，选择20 min为金银花绿原酸的较适宜提取时间。

2.2 响应面优化金银花绿原酸提取条件

2.2.1 金银花绿原酸响应面提取试验结果

依据金银花绿原酸提取的单因素试验结果，应用SAS9.3 软件实施四因素三水平的响应面试验，分析乙醇浓度、料液比、温度、时间对金银花绿原酸提取率的影响，响应面试验结果详见表2。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Results of Box-Benhnken design

续表2 响应面试验方案及结果Continue table 2 Results of Box-Benhnken design

2.2.2 响应面试验结果方差分析

根据表2 试验结果进行金银花绿原酸提取的响应面方差分析，详见表3。

表3 响应面法试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Benhnken design

由表3 可知，C、D、BC 对绿原酸提取的影响显著，B、A2、B2、C2、CD、D2对提取的影响非常显著。由 F 值的大小可以推断出，这4 个因素在所规定的范围内对金银花绿原酸提取的影响程度依次为B（料液比）＞C（超声温度）＞D（超声时间）＞A（乙醇浓度）。

应用SAS9.3 软件进行响应面回归分析，对乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4 个因素进行回归拟合，得到多元响应面回归模型：Y=-15.312 2+0.360 5A+0.415 167B + 0.207 167C - 0.066 25D - 0.001 237A2-0.000 45AB-0.001 125AC+0.000 375AD-0.007 3B2+0.002 9BC + 0.000 25BD - 0.001 662C2+ 0.001 85CD -0.001 175D2。回归模型P=0.000 2＜0.01，失拟项P=0.205 8＞0.05，说明回归方程显著、失拟项不显著，响应面回归方程的拟合程度良好。

2.2.3 响应面图分析

应用SAS9.3 对表3 数据进行分析，绘制出响应曲面图5～图10。

图5 乙醇浓度与料液比对绿原酸提取的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration and liquid ratio on the yield of chlorogenic acid

图6 乙醇浓度与超声温度对绿原酸提取的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

图7 乙醇浓度与超声时间对绿原酸提取的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

图8 料液比与超声温度对绿原酸提取的影响Fig.8 Effect of liquid ratio and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

图9 料液比与超声时间对绿原酸提取的影响Fig.9 Effect of liquid ratio and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

根据响应面回归方程及响应曲面图，因素BC、CD的交互作用明显。采用软件优化分析得出最佳提取条件为乙醇浓度 68.9%、料液比 1 ∶22.8（g/mL）、超声温度43.6 ℃、超声时间19.8 min。为了便于控制金银花绿原酸提取条件，提取参数设置为乙醇浓度69%、料液比 1 ∶23（g/mL）、超声温度 44 ℃、超声时间 20 min，进行绿原酸提取的3 次平行验证试验。依据试验方法1.2.1 和1.2.2 金银花绿原酸提取率平均值为6.20%，均高于响应面试验结果，故确定此方案为优化方案。

图10 超声温度与超声时间对绿原酸提取的影响Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonictime on the yield of chlorogenic acid

2.3 金银花绿原酸抗氧化能力分析

2.3.1 金银花绿原酸提取物的抗氧化能力评价

测定VC溶液、金银花绿原酸提取液、芦丁溶液系列浓度下DPPH 自由基清除率绘制浓度-清除率，见图11，计算抗氧化样品溶液的半数清除率IC50值、回归方程，详见表4。

图11 VC、绿原酸和芦丁对DPPH 自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on DPPH free radical of VC，chlorogenic acid and rutin

表4 VC、绿原酸和芦丁回归方程与IC50 值Table 4 Regression equation and IC50 on antioxidants of VC，chlorogenic acid and rutin

由图11、表4 可知，金银花绿原酸、VC、芦丁都具有较强的DPPH 自由基清除能力，且清除能力随着抗氧化样品溶液浓度的增大而增强。通过比较三者的半数清除率IC50值可知，金银花绿原酸抗氧化能力略强于VC，芦丁相比绿原酸、VC，抗氧化能力较差。

2.3.2 芦丁与绿原酸的协同作用

依据试验方法1.3.5，将浓度为30 μg/mL 金银花绿原酸和芦丁样品溶液，按照复配体积比为1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 进行混合，测定金银花绿原酸提取液与芦丁溶液的混合液DPPH 自由基清除率，分析二者间协同抗氧化效果，结果见图12。

图12 绿原酸与芦丁的协同抗氧化作用Fig.12 Synergistic antioxidant effect of chlorogenic acid and rutin

通过计算协同系数SE，分析5 种不同混合溶液抗氧化效果，金银花绿原酸与芦丁配比为9 ∶1 时SE 为1.05，均高于其他4 种混合溶液，协同增效作用明显。

3 结论

应用SAS9.3 软件建立金银花绿原酸提取的多项回归方程模型，方程拟合良好。在确定的4 个因素水平范围内，对金银花绿原酸提取的影响程度依次为B＞C＞D＞A，因素 BC、CD 交互作用明显。采用软件优化分析得出最佳提取条件为乙醇浓度69 %、料液比1 ∶23（g/mL）、超声温度 44 ℃、超声时间 20 min，验证结果为6.20%，与理论预测值接近，表明多项回归模型能较好的对金银花绿原酸的辅助提取进行预测。金银花绿原酸DPPH 自由基的半数清除率为21.09 μg/mL，具有明显的抗氧化活性。金银花绿原酸与芦丁具有一定的协同作用，复配比例9 ∶1 时SE 值为1.05，两者间协同增效作用明显。