黄玉川，梁坤，赵巍，刘锴，郑怡，包毅，邓永*

1 四川中烟工业有限责任公司，新型烟草制品中心，成都市锦江区成龙大道一段56号 610066；2 国家成都新药安全性评价中心，成都市高新区高朋大道28号 610041

吸烟有害健康是一个不争的事实，随着各国公共场所禁烟令的出台和实施，烟草行业寻求风险更低、环境烟气少的新型烟草制品。鼻烟具备的健康、环保属性吸引了越来越多的传统卷烟消费者的关注。

传统鼻烟是用发酵烟叶粉末加香料调制而成，以鼻吸用的无烟气烟草制品。益德成鼻烟是在研磨极细的优质烟草粉末中，掺入麝香、冰片等名贵药材或香草类物质，经过精细加工，并在封闭容器中陈化数年乃至数十年后才完成的一种深加工烟制物。宽窄∙益德成秀爽（简称秀爽）是将传统鼻烟与特种滤棒技术融合，打造的一款提神的无烟气烟草制品，是通过口腔空吸、鼻腔嗅吸，达到清新口气、醒脑、提神、通窍、缓解焦虑和疲劳之功效。本研究按照国家食品药品监督管理总局《药物非临床研究质量管理规范》（2017年9月生效）[1]，经济合作组织 OECD Principles of Good Laboratory Practice（as revised in 1997）ENV/MC.CHEM（98）17[2]要 求，对秀爽进行大鼠经口鼻吸入毒理学评价，观察秀爽对大鼠的生长发育及代谢的影响，为评价日常使用的安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

SPF级SD大鼠120只，体重120～180 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；宽窄∙益德成秀爽（正红）（W0545，中国）；戊巴比妥钠（Sigma，美国）；复方托吡卡胺滴眼液（美多丽，日本）；HRH-MNE3026小动物单浓度口鼻暴露系（北京慧荣，中国）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：120只健康SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养5天，采用PRISTIMA 7.2.0 版数据系统根据大鼠体重分性别随机分4组：对照组，W0545低、中、高剂量组，每组30只。

1.2.2 剂量设计：成人每日推荐经鼻吸入暴露5次，每次使用W0545约20 mg，每日合计使用约100 mg；每次吸入暴露时间约为1 min，每日合计暴露时间约为5 min。成人平均体重以60 kg计算，成人每日用以吸入暴露剂量为1.67 mg/kg（以W0545量计），大鼠等效吸入暴露剂量为10.35 mg/kg（以W0545 量计）。高、中、低剂量组：（1）吸入暴露剂量为103.5 mg/kg（以W0545量计），为人用剂量的62倍、大鼠等效吸入暴露剂量的10倍；（2）大鼠吸入暴露低、中、高剂量组的吸入暴露时间分别设为5 min、15 min、50 min，分别为人吸入暴露时间的1倍、3倍、10倍；（3）对照组动物放置在小动物单浓度口鼻暴露系统中吸入暴露环境空气50 min。

图1 小动物单浓度口鼻暴露系统工作原理图Fig.1 Working principle of single concentration oral and nasal exposure system for small animals

1.2.3 吸入装置工作原理及暴露方法：小动物单浓度口鼻暴露系统（HRH-MNE3026型组合式单浓度动等线物口鼻吸入暴露系统）主要包括发生系统、稀释系统、采样系统、监控系统、测量系统等部分。其工作原理图1如下所示。洁净的压缩空气经过质量流量控制器（MFC1）产生稳定流量的空气进入collison型气溶胶发生器，collison型气溶胶发生器内放置秀爽逸散气体发生瓶，瓶内装有一次染毒所需秀爽，通过一定流速的气体将秀爽挥发性成分带出用于染毒给药的气溶胶。该气溶胶进入上方的稀释器，经过由质量流量控制器（MFC2）控制的稀释空气稀释，产生稳定浓度的气溶胶，以满足总给药气体体积为500 mL/只/分钟的给药。进入高剂量组的气溶胶输送管供高剂量组的动物口鼻暴露吸入。未被动物吸入的气体被系统以一定流量的速度抽走，同时暴露气流持续产生，保证本实验的一个动态的染毒系统。通过监测系统对整个吸入暴露实验过程中温度、湿度、染毒腔压差、屏蔽柜压差、氧气浓度、二氧化碳浓度实时监测。

将大鼠按组别放置在小动物单浓度口鼻暴露系统的装置中，经口鼻吸入W0545挥发气体，每天吸入1次，连续吸入14天[3]，停止吸入恢复4周。首次吸入当天定义为暴露期第1天，末次吸入后1天定义为恢复期第1天。给药过程中，小动物单浓度口鼻暴露系统的环境参数要求：平均氧气浓度不低于20.63%，平均二氧化碳浓度不高于0.19%，平均温度21.5～23.8℃，平均相对湿度26.8～40.0%，平均暴露腔内压差-228.15～0.96pa。

1.2.4 动物观察及检测检查：暴露期及恢复期每天观察各组大鼠一般状况；暴露期每周测定2次体重及摄食量，恢复期每周测定1次。观察动物各组所有存活大鼠，包括但不限于大鼠存活率，摄食与饮水量，口鼻、外观体征，被毛，一般行为活动，精神状态，腺体分泌，皮肤和粘膜颜色，呼吸状态，粪便性状，生殖器等情况及其它非常态症状。检测检查指标包括眼科检查、血液学检查、血液生化检查、尿液检查、骨髓涂片、大体解剖观察和组织病理学检查。

1.3 统计学方法

所有数据由SPSS22.0 进行分析，体重、摄食量等定量指标采用均数±标准差（± SD）描述。采用Dunnett’s t检验（Dunnett法）对组间差异进行比较；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 一般状况

给药期及恢复期，各组大鼠一般状况良好、自主活动正常、皮肤被毛清洁，亦未见其它毒性反应。

2.2 体重

给药期间及恢复期间，经口鼻吸入秀爽后，各组雌、雄鼠体重与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图2与图3。

图2 经口鼻吸入暴露秀爽对雄性SD大鼠体重的影响Fig.2 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

图3 经口鼻吸入暴露秀爽对雌性SD大鼠体重的影响Fig.3 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

图4 经口鼻吸入暴露秀爽对雄性SD大鼠摄食量的影响Fig.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of male SD rats

图5 经口鼻吸入暴露秀爽对雌性SD大鼠摄食量的影响Fig.5 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of female SD rats

2.3 摄食量

给药期第11～12天，高剂量组雌鼠摄食量与对照组相比升高，差异有统计学意义（P≤0.05），无毒理学意义。

除此之外，给药期间及恢复期间，经口鼻吸入秀爽后，各组雌、雄鼠摄食量与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图4与图5。

2.4 眼科检查

暴露结束及恢复期结束，对照组和高剂量组大鼠双眼屈光介质、视盘清晰，视网膜动脉管径粗细均匀，静脉无明显扩张，亦未见视网膜、视盘以及角膜、虹膜、晶状体、前房、后房等其它异常改变。

2.5 血液学

给药结束及恢复期结束，各给药组大鼠白细胞（WBC）及各分类计数及百分比、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞容积（HCT）、平均红细胞容积（MCV）、平均红细胞容积（MVC）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、网织红细胞（RET）、网织红细胞百分比（RET%）、活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶原时间PT等血液生化指标均未见明显差异改变（见表1）。

2.6 血液生化

给药结束及恢复期结束，各给药组大鼠天门冬氨基酸基转移酶（AST）、丙氨酸氨基酸转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿素（Urea）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白球比（A/G）、血糖（GLU）、总胆红素（TBIL）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯TG、Na+、K+、Cl-、Ca、P、胰淀粉酶（AMY-P）、脂肪酶（LIPC）等血液生化指标均未见明显差异变化（见表2）。

表1 经口鼻吸入暴露秀爽对SD大鼠血液学指标的影响Tab.1 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on hematological parameters in SD rats

续表1

表2 经口鼻吸入暴露秀爽对雄性SD大鼠血液生化指标的影响Tab.2 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on blood biochemical indicators in male SD rats

续表2

续表2

2.7 尿液检查

给药结束及恢复期结束，各给药组雌、雄鼠尿液颜色、清澈度、葡萄糖、胆红素、酮体、潜血、酸碱值、蛋白、尿胆原、亚硝酸盐、白细胞、比重均未见明显异常改变（见表3）。

表3 经口鼻吸入暴露秀爽对SD大鼠尿液检查指标的影响Tab.3 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on urine examination indicators in SD rats

续表3

2.8 脏器重量及系数

给药结束及恢复期结束，各给药组雌、雄鼠脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫的脏器重量、脏体/脏脑系数未见明显异常改变（见表4）。

表4 经口鼻吸入暴露秀爽对SD大鼠脏器系数的影响Tab.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuangon organ coefficient in SD rats %

续表4

2.9 大体解剖观察

暴露结束及恢复期结束，各给药组所解剖大鼠大体肉眼观察脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、胃肠道、生殖脏器等主要脏器，其大小、形态、颜色或质地均未见异常改变。

图6 对照组大鼠重要脏器组织病理学检查结果Fig.6 Histopathological examination of important organs in rats of control group

2.10 组织病理学检查

暴露结束及恢复期结束，对照组和高剂量组大鼠脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、胃肠道、生殖脏器等主要脏器或组织均未见与供试样品相关的异常组织病理学改变，见图6、图7。

图7 暴露结束高剂量组大鼠重要脏器组织病理学检查结果Fig.7 Histopathological examination of important organs in rats of high dose group

3 分析与讨论

随着各国反吸烟运动的日益增强，降低传统烟草制品对消费者健康风险，开发新型烟草制品成为烟草行业追逐的热点[4]。2011年，美国FDA授权IOM制订了“MRTP研究的科学标准”[5]，为新型烟草制品的健康风险评估提供了一个指导性框架。根据该框架，MRTP健康风险评估主要包括烟草制品成分的化学分析、临床前毒理学研究、临床研究和长期随访研究。临床前毒理学研究是评估程序中一个重要组成部分，通过毒理学评价的新型烟草制品方可进入临床评估阶段，以确保进入临床评估阶段的产品对人体风险较低，同时具有较高的“安全性”可能[6-13]。

按照产品的类型，无烟气烟草制品分为美国湿含烟（Moist snuff）、瑞典含烟 Snus、含化型烟草制品（Dissolvable tobacco products，DTPs）、胶基型烟草制品、嚼烟、干含烟（Dry snuff）、西欧鼻烟、亚洲鼻烟等多种产品形式[14]，鼻烟主要通过鼻粘膜吸收其中的香味物质和/或生理强度物质，嚼烟和口含烟主要通过口腔黏膜吸收其中香味物质和生理强度物质。目前对无烟气烟草制品安全性评价主要集中在有害化学成分分析，秦亚琼等人[15]对国内外近30年关于无烟气烟草制品化学成分分析的文献进行了全面概述。①大部分文献聚焦在无烟气烟草制品中水分、pH、烟碱总含量、游离态烟碱含量、TSNAs的分析测定方面；对其他常规化学成分、添加剂、有害成分（除TSNAs）关注较少，但近年来呈逐渐增加趋势。②在含量水平上，不同品牌、类型产品的常规化学成分及指标、添加剂、有害成分含量存在明显差异。③在分析方法上，常规化学成分及添加剂的分析方法以GC和GC-MS为主；对于有害成分，大多采用GC-MS/MS或LC-MS/MS 进行检测；目前对体内毒理学研究较少。

本文使用的宽窄∙益德成秀爽（正红）为一种新型封闭场所醒脑提神的无烟气烟草制品，基础原料来自非物质文化遗产传承单位天津益德成的鼻烟粉“人参益气散”。主要成分包括人参、石菖蒲、白寇、白芷、薄荷等，人参大补元气，补脾安神为君药；菖蒲开窍豁痰，醒神益智为臣药；白芷、白寇上行头目而清窍，兼能燥湿升阳，为佐药，薄荷清凉走窜为史药。宽窄益德成秀爽（正红）采用玻态干燥技术制备秀爽专用锁香和释香颗粒，解决鼻烟粉香味容易散失和加工过程中流动性差的问题，通过MCT溶剂萃取法提取天然香料制备爆珠，借助三元复合空腔滤棒模拟鼻烟壶盛装鼻烟粉（结构见图8）。消费者通过一嗅、二捏、三分、四挤、五吸的方式消费秀爽；可鼻吸，达到醒脑提神、缓解焦虑疲劳；可口腔空吸，达到清新口气的作用。

图8 秀爽烟支结构示意图Fig.8 Structural sketch of Xiushuang cigarette

管莹等[6]采用染毒24 h后MTT、细胞凋亡观察电子烟烟液进行细胞毒性实验。刘炘等[16]采用大鼠30 d喂养相当于人体推荐摄入量100倍观察沸玉菁茶安全性。通过与国家成都新药安全性评价中心专家沟通，结合食品毒理学实验教材指导建议：“在新药安全性评价中，试验期限等于或小于14 d”，加之研究经费原因，本研究参照新药安全性评价方式，依从CFDA的GLP规范，对宽窄益德成秀爽进行为期14 d的大鼠口鼻暴露吸入毒理学评价。根据消费者每日推荐使用量换算大鼠暴露计量，最大暴露量为成人62倍，暴露时间为成人10倍。研究发现SD大鼠连续14 d、每天连续5 min、15 min、50 min以口鼻暴露方式吸入103.5 mg/kg剂量的宽窄益德成秀爽（正红），暴露结束后恢复4 w，各组大鼠一般状况、体重、摄食量、眼科检查、血液学及血液生化检查、尿液检查、脏器重量及系数、大体解剖观察及组织病理学检查均未见明显异常。由此推测在本研究剂量范围内，宽窄益德成秀爽是安全的无烟气烟草制品。

烟草行业普遍采用30 d或90 d的亚慢性毒性实验进行口鼻暴露的卷烟烟气毒理学研究。临床药物进入申报流程一般需要提供4 w毒性实验结果，但在用药剂量选择中普遍采用7 d或14 d的毒性实验。本研究因经费有限，结合临床药物剂量选择最低要求，观察大鼠14 d口鼻暴露宽窄益德成秀爽的实验研究。因染毒周期较短，研究结论存在一定的偏差，以期在后续研究中延长染毒周期，结合免疫组织化学、PCR等技术观察宽窄益德成秀爽使用安全性。

此外，本研究中爆珠香味成分为MCT溶剂萃取法提取秀爽中挥发性有效成分，本研究只对秀爽颗粒成分进行吸入安全性评价，未对整个秀爽烟支结构及爆珠进行捏碎后的吸入安全性评价。后续研究中会针对这个烟支结构及爆珠进行相关安全性评价。

4 结论

采用HRH-MNE3026型组合式单浓度动物口鼻吸入暴露系统建立大鼠口鼻暴露吸入毒理学评价实验方案。经过14 d连续暴露宽窄益德成秀爽（正红），与空白对照组相比，各受试组大鼠日常状态、生理代谢指标、血液理化指标、组织病理学检查等无明显异常，为秀爽系列产品的使用安全性提供了依据。