陈颐，张笑，杨志怀，胡彬彬，徐鸿飞，邹聪明，冀新威

1 云南省烟草农业科学研究院，昆明 650031；2 云南省香料烟有限责任公司，保山 678000；3 云南省烟草公司，昆明 650011；4 云南省烟草公司红河州公司，红河 652300

蛋白质是烟草中含量最为丰富的一类十分重要的化学组分，它们不仅具有重要的生理功能，能调控烟叶内的能量代谢和物质转化，而且对烟叶最终质量有决定性影响[1-2]。烟叶在成熟过程中，蛋白质含量、组分和结构不断发生变化，而这些变化直接影响着烟叶的烘烤特性和烤后烟叶质量[3-4]。烟叶成熟度不同，其蛋白质含量差异很大，烘烤过程中控制烟叶蛋白质含量并不追求一味地降低，而是降至一个适宜的范围。因此，从烟叶采摘成熟度出发，通过合理调控密集烘烤参数对促进烟叶蛋白质的降解和烟叶品质的提高是现代烟叶烘烤技术的重要组成部分。

目前，国内外围绕烘烤过程烟叶蛋白质降解规律开展了大量研究。李婷婷等[5]对不同烘烤方式下烟叶蛋白质含量及相关酶活性进行了研究，发现烟叶蛋白酶活性呈现“上升-下降-上升-下降”的“双峰曲线”，并且初步得出“两炖一停”密集烘烤方式最有利于提高烟叶蛋白质酶活性，从而加速蛋白质分解。艾复清等[6-7]研究了K326和红花大金元品种中上部烟叶烘烤过程中蛋白质以及相关酶活性的变化，发现适当延长变黄期时间，调控变黄相对湿度可降低不同部位烟叶蛋白质含量。李常军等[8-9]分别从温度和湿度单一变量入手研究了烟叶蛋白质变化，结果表明蛋白质的降解程度主要受烟叶中蛋白酶活力水平的影响，酶活性又受温湿度的影响，蛋白质降解的实质就是在一定温湿度条件下，相关酶作用的结果。贺帆等[10]研究发现，密集烘烤低温中湿变黄处理烟叶蛋白酶活性较高，有利于烟叶内蛋白质的降解。目前，植物体内蛋白质的降解被普遍认为先由内肽酶起作用，将蛋白质水解成多肽，再由外肽酶将多肽水解成氨基酸，其中外肽酶根据其所剪切肽链末端的不同又分为氨肽酶和羧肽酶[11]。上述研究对烟叶烘烤过程中蛋白质变化机理上虽有所探触，但不够系统。

本文研究了K326品种不同成熟度中部烟叶在密集烘烤过程中蛋白质含量、内肽酶活性、外肽酶活性和游离氨基酸含量的动态变化，旨在为阐明烟叶烘烤过程中蛋白质降解机理以及提高烟叶质量提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2018年4月～9月于云南省玉溪市江川区九溪镇（东经102°38′，北纬24°18′，海拔1730 m）进行，供试品种为K326，由玉溪中烟种子有限责任公司提供。选取中部烟叶尚熟、适熟和过熟3种成熟度档次鲜烟叶样品作为试验材料，3种成熟度档次标准见表1。

表1 K326鲜烟叶不同成熟度档次标准Tab.1 The classification standard of tobacco leaves K326 with different maturity

1.2 试验设计

不同成熟度烟叶采摘、编竿，确保烟叶部位均衡一致，采用当地密集烤房中进行烘烤。烘烤工艺依据玉溪烟区主推烘烤模式进行（见图1）。

烟叶取样：烟叶烘烤前取样1次，在整个烘烤过程中每12个小时取样一次，共取样13次。每次选取烘烤过程中各处理具有代表性的叶片5片，切去叶尖和叶基部，留叶中间部分，每次取样必须是装在同一层相同叶位的烟叶，干冰保存，并放入-80℃低温冰箱待用。

图1 玉溪烟区密集烤房烘烤技术主推工艺图Fig.1 Main technical diagram of flue-curing barn in Yu-xi tobacco area

1.3 测定方法

烟叶蛋白质含量和游离氨基酸含量：采用考马斯亮蓝法和茚三酮法进行测定[12-13]。所用仪器Lambda 650紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司）。烟叶蛋白质含量和游离氨基酸含量变化幅度的计算方法[14]：PCt%=（ECt1-ECt2）/ECt1×100 %。式中：ECt1表示任意取样时刻t样品的物质含量；ECt2表示任意时刻t下一次样品的物质含量。

烟叶内肽酶（endopeptidase）活性：采用ELLISA法用植物内肽酶酶联免疫分析测定试剂盒（武汉伊艾博科技有限公司）进行测定。称取烟样0.1 g，加入1 mL的PBS缓冲液（pH7.4），低温下快速研磨，4℃离心10 min（8000 r/min），收集上清液待检测酶活。在酶标板上空白孔加样品稀释液50 μL，余孔分别加入标准品或待测样品50 μL。接着在每孔加入检测溶液A工作液50 μL。盖上覆膜，轻拍以混匀，37℃孵育60 min。然后弃去孔内液体，甩干，洗涤液洗涤3次，每次浸泡1～2 min，大约300 μL/孔，甩干。每孔加入检测溶液B工作液100 μL，酶标板覆膜37℃孵育60 min。然后弃去孔内液体，甩干，再洗涤3次，每次浸泡1～2 min，大约300 μL/孔，甩干。然后依序每孔加底物溶液90 μL，覆膜，37℃避光孵育10～20 min（标准孔前3～4孔有梯度蓝色显现）。然后依序每孔加入终止溶液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色，注意混匀。然后立即用酶联仪检测450 nm波长下各孔的吸光值（OD值）。然后以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度即为样品的实际浓度。所用仪器为SpectraMax 190光吸收型酶标仪(美国Molecular Devices公司) ，AC8洗板机(Thermo Labsystems)。

烟叶氨肽酶（aminopeptidase）活性：采用ELLISA法用植物氨肽酶酶联免疫分析测定试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司）进行测定。称取烟样0.1 g，加入1 ml的PBS缓冲液（pH7.4），低温下快速研磨，4℃离心10 min（8000 r/min），收集上清液待检测酶活。在酶标包被板上加入待测样品和标准品，标准孔里加入标准品 50 μL，待测样品孔先加样品稀释液 40 μL，然后再加待测样品10 μL（样品最终稀释度为 5 倍），空白孔不加。然后覆膜后置于37℃温育30 min。然后弃去孔内液体，甩干，洗涤液洗涤5次，每次浸泡30秒，大约300 μL /孔，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。然后覆膜后置于37℃温育30 min。然后弃去孔内液体，甩干，洗涤液洗涤5次，每次浸泡30 s，大约300 μL /孔，拍干。然后每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，混匀，37℃避光显色10 min。然后每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。然后立即用酶联仪检测450 nm波长下各孔的吸光值（OD值）。测定应在15 min内进行。然后以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

烟叶羧肽酶（Carboxypeptidase）活性测定同氨肽酶活性测定方法。

1.4 数据统计

所有数据均采用EXCEL 2016、SPSS 22.0和Origin 8.0分析软件进行方差分析、计算和统计作图表。

2 结果与分析

2.1 烘烤过程中烟叶蛋白质含量的变化

图2 烘烤过程中烟叶蛋白质含量变化Fig.2 Changes of the protein content in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度烟叶烘烤过程中蛋白质含量的动态变化见图2。由图可知，在烘烤过程中随着时间延长，不同成熟度烟叶蛋白质平均含量从14%持续下降至5%左右，并且在24～36 h范围下降幅度最大。由表2可知，在烘烤时间24～36 h和36～48 h期间，不同成熟度烟叶蛋白质含量的下降幅度均存在极显著性差异（P＜0.01）。其中过熟和适熟烟叶蛋白质含量降解速率较快，两者降幅均达到19%以上，而尚熟烟叶蛋白质含量降解速率较缓慢。这表明在烘烤过程变黄期过熟和适熟烟叶蛋白质分解较充分，而尚熟烟叶蛋白质分解不够充分。

表2 烘烤过程中不同成熟度烟叶蛋白质含量的下降幅度Tab.2 The descent range of the protein content in tobacco leaves with different maturity during flue-curing process

2.2 烘烤过程中烟叶内肽酶活性的变化

不同成熟度烟叶烘烤过程中内肽酶活性的动态变化见图3。由图中可知，随密集烘烤时间延长，不同成熟度烟叶内肽酶活性变化趋势基本一致，呈现“上升-下降-上升-下降”的“双峰曲线”。这表明烟叶中可能存在两种结构、活性或分布不同的内肽酶同工酶[16]。其中第1个波峰出现在烘烤36 h，酶活力为116.46 ng/g，第2个酶活性最高峰出现在烘烤84 h，酶活为77.12 ng/g，此后急剧下降。这说明烟叶内肽酶主要在烘烤变黄前期大量表达，随着温度进一步升高，其中一种内肽酶同工酶变性失活，而另一种活性低的内肽酶随之表达。不同成熟度烟叶内肽酶活性在烘烤时间24 h、36 h和48 h均存在极显著性差异（P＜0.01），其中过熟和适熟烟叶内肽酶活性极显著高于尚熟烟叶，这表明内肽酶耐温性较低，烘烤温度超过36 ℃ 将导致该酶逐渐变性失活，且尚熟烟叶由于内肽酶表达量相对较少，故相同温度条件下酶活性更低。

图3 烘烤过程中烟叶内肽酶活性变化Fig.3 Changes of the endopeptidase activity in tobacco leaves during flue-curing process

2.3 烘烤过程中烟叶氨肽酶活性的变化

不同成熟度烟叶烘烤过程中氨肽酶活性的动态变化见图4。由图中可知，烘烤过程中随烘烤时间的延长，烟叶的氨肽酶活性均增加，当烘烤时间达到72 h的变黄后期时，氨肽酶活性达到最高值300.52 ng/g，此后酶活性快速下降。这表明烘烤烟叶氨肽酶活性的最适温度在变黄后期42 ℃左右，超过此温度该酶将迅速变性失活。此外，不同成熟度烟叶氨肽酶活性在烘烤时间36 h、48 h、60 h和72 h均存在极显著性差异（P＜0.01），其中烟叶氨肽酶活性表现为尚熟烟叶＞适熟烟叶＞过熟烟叶。

2.4 烘烤过程中烟叶羧肽酶活性的变化

图4 烘烤过程中烟叶氨肽酶活性变化Fig.4 Changes of the aminopeptidase activity in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度烟叶烘烤过程中羧肽酶活性的动态变化见图5。与氨肽酶变化趋势相似，在烘烤时间达到72 h时，羧肽酶活性达到最高值，为47.26 ng/g，此后酶活性快速下降。这表明烘烤烟叶羧肽酶活性的最适温度在变黄后期42 ℃左右，超过此温度该酶活性急剧下降。不同成熟度烟叶羧肽酶活性在烘烤时间36 h、48 h、60 h和72 h均存在极显著性差异（P＜0.01），其中烟叶羧肽酶活性表现为尚熟烟叶＞适熟烟叶＞过熟烟叶，与氨肽酶活性变化表现出相同的规律。

2.5 烘烤过程中烟叶游离氨基酸含量的变化

图6 烘烤过程中烟叶游离氨基酸含量变化Fig.6 Changes of the amino acid content in tobacco leaves during flue-curing process

不同成熟度烟叶烘烤过程中游离氨基酸含量的动态变化见图6。由图可知，随着烘烤时间延长，不同成熟度烟叶游离氨基酸含量变化差异很大，其中尚熟烟叶游离氨基酸平均含量呈现持续上升的变化趋势，而适熟和过熟烟叶呈现“上升-下降-上升”的变化趋势。这说明适熟和过熟烟叶中的游离氨基酸含量在烘烤时间72～84 h范围内达到最大值后，随着美拉德反应而转化为美拉德产物，而尚熟烟叶中的美拉德反应受某种因素影响，游离氨基酸不能转化为美拉德产物，因而游离氨基酸随蛋白质降解而持续升高[17]。由表3可知，在烘烤时间24～144 h期间，不同成熟度烟叶游离氨基酸含量的变化幅度存在极显著性差异（P＜0.01）。其中在烘烤变黄期和定色前期（烘烤时间24～84 h），尚熟烟叶游离氨基酸含量上升幅度较快，而在烘烤定色后期和干筋期（烘烤时间120～144 h），适熟和过熟烟叶游离氨基酸含量上升幅度较快。

表3 烘烤过程中不同成熟度烟叶游离氨基酸含量的变化幅度Tab.3 The change range of the amino acid content in tobacco leaves with different maturity during flue-curing process

3 讨论与结论

烟叶烘烤是烟叶内大分子的有机物降解、转化的生理生化变化过程和烟叶脱水干燥的物理过程的统一[18-20]。本研究结果表明，过熟和适熟烟叶蛋白质含量降解速率较快，而尚熟烟叶蛋白质含量降解速率较缓慢；过熟和适熟烟叶内肽酶活性极显著高于尚熟烟叶，但氨肽酶和羧肽酶活性均表现为尚熟烟叶＞适熟烟叶＞过熟烟叶。由此可见，由于过熟和适熟烟叶成熟度高，烟叶细胞壁和细胞膜较疏松，水分含量多，内肽酶表达量高，因而有利于烟叶蛋白质快速水解[15]。而尚熟烟叶成熟度低，烟叶细胞壁和细胞膜较紧密，水分含量相对较少，内肽酶表达量较低，因而蛋白质降解速率慢，虽然尚熟烟叶的氨肽酶和羧肽酶活性相对高于过熟和适熟烟叶，但受内肽酶作用的限制，氨肽酶和羧肽酶难以将分子量较大的多肽链水解为氨基酸[21]。因此，尚熟烘烤烟叶的蛋白质含量高，是其烟叶感官评吸质量差的主要原因，这与徐兴阳等[22]人研究结果相符。

肽酶是一类促进可溶性蛋白质降解为游离氨基酸的关键酶。按剪切多肽链位置的不同，肽酶可分为内肽酶和外肽酶两大类，其中外肽酶根据作用肽链末端的不同，又分为氨肽酶和羧肽酶两类，它们是多肽链最后生成游离氨基酸的限速酶[23-24]。本研究结果表明，适熟和过熟烟叶的氨肽酶和羧肽酶活性最大时的温度（烘烤时间72 h）明显高于内肽酶，并且内肽酶活性最大时的温度（烘烤时间36 h）与蛋白质含量最大下降幅度相对应，氨肽酶和羧肽酶活性最大时的温度（烘烤时间72 h）与游离氨基酸含量最高值相对应。由此可见，烘烤过程中烟叶蛋白质的含量高低与内肽酶活性密切相关，烟叶游离氨基酸含量与氨肽酶和羧肽酶活性密切相关。本试验结果表明，烟叶内肽酶活性变化呈现“上升-下降-上升-下降”的“双峰曲线”。这表明烟叶中可能存在两种结构、活性或分布不同的内肽酶同工酶[16]。有关烤烟中内肽酶的结构、性质及分布还有待今后进一步研究。

贺帆等[10]研究表明烘烤过程中烟叶内肽酶活性变化与中性蛋白酶活性相似，分别在烘烤24 h和36 h达到酶活最大值。本试验结果表明，不同成熟度烟叶蛋白质含量在烘烤24～48 h范围下降幅度最大；内肽酶在烘烤36 h活性最高，氨肽酶和羧肽酶在烘烤72 h活性最高；适熟和过熟烟叶中的游离氨基酸含量在烘烤变黄期转入定色期的72～84 h范围内达到最大值。由此可见，烘烤时间在24～72 h范围是内肽酶、氨肽酶和羧肽酶催化蛋白质有效降解的关键时期，超过该烘烤时间范围，随着这些蛋白水解酶的变性失活，蛋白质的降解将终止。此外，本试验结果显示，尚熟烟叶游离氨基酸含量持续上升，而适熟和过熟烟叶呈现“上升-下降-上升”的变化趋势。造成这现象的原因可能与适熟和过熟烟叶烘烤过程中游离氨基酸发生非酶棕色化反应有关[25-26]。唐乐攀等[27]研究指出反应温度和时间是美拉德反应重要的动力学因素，随着反应温度的升高，反应速率加快。根据Hodge提出的美拉德反应路线可以看出，反应时间决定着美拉德反应所处的阶段，初级阶段主要是氨基酸和还原糖的消耗。本研究也表明，烘烤时间是影响美拉德反应将烟叶游离氨基酸转化为美拉德产物的决定因素。有关烟叶成熟过程中的蛋白质积累和肽酶基因表达及其与烘烤过程中蛋白质降解和美拉德产物形成的机理还有待今后进一步研究。