曾莎莎，梁延鹏,2，覃礼堂，莫凌云，曾鸿鹄,2,*

1. 桂林理工大学环境科学与工程学院， 桂林 541004 2. 广西环境污染控制理论与技术重点实验室，桂林 541004 3. 岩溶地区水污染控制与用水安全保障协同创新中心，桂林 541004 4. 广西环境污染控制理论与技术重点实验室科教结合科技创新基地，桂林 541004

有机磷农药(organophosphorus pesticides, OPs)是指组分上含磷的有机农药，以具有高效、易降解和低残留的特点在19世纪70年代取代了有机氯农药，在农业中被广泛施用[1]。OPs的大量生产和施用使得OPs通过地表径流等过程成为水体中普遍存在的污染物。尽管水体中检出的OPs可以被认为是以“无可见有害作用水平”的浓度存在，但是这些低浓度下存在的多种OPs的组合毒性效应不可忽视[2]。OPs可通过抑制水生生物体内重要酶的活性，导致水生生物的死亡[3]。OPs对胆碱酯酶的抑制作用势必会对水环境中非靶标生物甚至人类的生存和健康产生威胁[4]。因此，亟需开展OPs对水生生物的联合毒性研究。

目前，环境研究工作者针对OPs水生生物联合毒性展开了系列研究，朱涛等[5]把Floater-Hormann插值法理论用于OPs对线虫的联合毒性的评估，结果显示，敌敌畏与乐果的联合作用不仅表现为加和作用，还在局部低浓度呈现拮抗作用；Zhang等[6]以青海弧菌Q67为受试生物，考察马拉硫磷等6种OPs的联合效应，发现OPs的毒性相互作用多数服从加和作用；Zeng等[7]探究甲基对硫磷等5种OPs对大型溞的联合毒性，发现OPs的联合毒性可用浓度加和(CA)模型预测评估；戴家银等[8]研究发现甲基异柳磷与甲胺磷对真鲷及平鲷幼体的联合毒性为协同作用；Tien等[9]发现毒死蜱、特丁硫磷和甲胺磷对当地河流分离出的3种本土藻类的联合毒性表现为拮抗作用。以上研究主要集中于水生动物的联合毒性，对标准藻类研究较少。复合污染物的联合毒性相互作用(加和、协同和拮抗作用)受混合组分的影响，可能具有浓度水平依赖性[10-11]。这促使笔者系统思考OPs对淡水绿藻的联合毒性效应具有怎样的变化规律，其混合物毒性及其毒性相互作用有无组分浓度水平依赖性。

绿藻作为淡水生态系统中的初级生产者及水生食物链的基本环节[12]，对淡水生态系统中绿藻的任何外源性干扰都可能导致整个水生态系统失衡。因此，开展污染物对淡水绿藻的毒性作用研究具有实际意义。蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)属绿藻门，小球藻属，是游离单细胞藻，因繁殖快、藻液分布均匀不易沉降、以及与污染物接触充分等原因，成为水环境毒理学常用的标准试验淡水绿藻种[13]。葛会林等[14]研究了有机磷与三嗪农药对斜生栅藻的联合毒性，而有关5种OPs对C. pyrenoidosa的联合毒性及毒性相互作用研究尚未见有报道。

因此，本研究以农业中年使用量达1 000～30 000 t的5种OPs[15]：敌百虫(trichlorfon, TRC)、马拉硫磷(malathion, MIT)、敌敌畏(dichlorvos, DDVP)、氧乐果(omethoate, OMT)和乐果(dimethoate, DIT)为混合组分，以C. pyrenoidosa为受试生物，采用直接均分射线法设计二元混合物，测定OPs单一及混合物的浓度-效应数据，以基于95%观测置信区间(observation-based confidence interval, OCI)的组合指数(combination index, CI)法[16-17]探讨OPs二元混合物在不同效应水平下对C. pyrenoidosa的毒性相互作用规律，并初步分析OPs混合物的毒性特点，以期为科学评估OPs水生生态风险提供基础数据，为OPs在农业上的合理施用提供参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验藻种为蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)，购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库(FACHB)，编号为FACHB-5。该藻采用BG11培养基，放入恒温光照培养箱中，于22 ℃、照度3 000 lx和光暗比12 h∶12 h条件下培养。实验时采用处于对数生长期的藻。

5种OPs包括TRC、MIT、DDVP、OMT和DIT，纯度均大于98%。TRC、DDVP和OMT购于德国的DrEhrenstorfer GmbH公司，MIT和DIT购于美国的CATO公司。5种OPs的基本信息见表1，化学结构式见图1。

1.2 毒性测试、曲线拟合及混合物设计

C. pyrenoidosa的毒性测定参照文献[18]。生长抑制毒性表达为毒物对C. pyrenoidosa的生长抑制率I：

I=1-(ODt,i-ODt,0)/(OD0,i-OD0,0)

(1)

式中：ODt,i和ODt,0分别是实验组96 h和0 h后藻液的光密度(OD)值；OD0,i和OD0,0分别是空白对照组96 h和0 h后藻液的OD值。

采用非线性函数Weibull拟合实验数据，表达式如下：

y=1-exp(-exp(α+β×1og10(c)))

(2)

式中：α、β是函数的位置参数及斜率参数；y为效应，即毒物对指示生物的抑制率；c为毒物的浓度。

OPs二元混合体系采用直接均分射线法(EquRay)设计，共9个混合物体系，每个OPs混合体系设置了5条混合射线，共45条混合射线[19]。各个混合射线包含的OPs组分及各组分的浓度比(pi)见表2。

1.3 毒性相互作用评估

本文用基于的95% OCI的组合指数(CI)探讨OPs对C. pyrenoidosa的毒性相互作用。混合物浓度-效应曲线的95% OCI定义如下[20]：

(3)

式中：y为浓度-效应曲线(CRCs)拟合函数；α为显著性水平(α = 0.05)；t为自由度(n-m)在置信水平为α下的临界值，可由t分布表查；C为由非线性最小二乘回归得到的参数估计值的协方差矩阵；s为观测值标准偏差。

图1 5种OPs的化学结构Fig. 1 The chemical structure of five OPs

表1 5种有机磷农药(OPs)的理化性质及其浓度-效应曲线的Weibull拟合参数Table 1 Physicochemical properties and Weibull fitting parameters for concentration-effect curve of five organophosphorus pesticides (OPs)

注：pEC50为半数效应浓度EC50的负对数值。

Note: pEC50refers to the negative logarithm of EC50value.

表2 OPs混合物对C. pyrenoidosa的Weibull拟合模型参数和毒性数据Table 2 Weibull fitting model parameters and toxicity data for OPs binary mixtures to C. pyrenoidosa

注： x%表示效应水平；ADD表示加和作用，ANT表示拮抗作用。

Note: x% indicates effects level; ADD stands for additive action, ANT stands for antagonism.

设n个组分构成的多元混合物在x%效应下的混合物组合指数(CI)定义如下[21]：

(4)

式中：ECx,i是混合物中第i个组分单独施用时产生x%效应的浓度；pi是第i个组分在混合物中的浓度比；混合物实验浓度(ECx,Obs)则通过Weibull反函数计算。

利用95% OCI的ECx,Obs的置信区间上限(ECx,Up)和下限(ECx,Low)替代式(4)中的ECx,Obs，获得CI的置信区间上下限(CIUpper、CILower)：

(5)

(6)

通过对CI与95% OCI的综合分析，在指定效应下，CILower>1时为拮抗作用，CIUpper<1时为协同作用，CILower<1

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 5种OPs对C. pyrenoidosa的单一毒性

5种OPs对C. pyrenoidosa的浓度-效应数据均可通过Weibull函数拟合，其拟合模型参数(回归参数α和β值，统计参数R2和RMSE)见表1，表中5种OPs的R2值均大于0.96且所有RMSE值均小于0.06，这表示了拟合质量的可靠性。图2则显示了这5种OPs的浓度-效应拟合曲线(CRCs)，呈经典S型。以pEC50作为毒性指标，pEC50的数值越大，毒性越大[22]，则5种OPs对C. pyrenoidosa的毒性顺序为：TRC(pEC50=3.89)>MIT(pEC50=3.77)>DDVP(pEC50= 3.63)>OMT(pEC50=3.44)>DIT(pEC50=3.27)。其毒性大小顺序与浮游植物的结果大致相同[23]。

图2 5种OPs对C. pyrenoidosa的浓度-效应曲线(CRCs)注：图中散点表示实测数据，实线表示拟合线；下同。Fig. 2 The concentration-response curves (CRCs) of five OPs to C. pyrenoidosa Note: Dispersed points and solid lines in the diagram refer to the observed data and fitted lines, respectively. The same below.

图3 9组OPs二元混合物体系的各混合物射线对C. pyrenoidosa的拟合浓度-效应曲线Fig. 3 The fitted concentration-effect curves of various rays in 9 groups of OPs binary mixtures to C. pyrenoidosa

2.2 OPs二元混合物对C. pyrenoidosa的联合毒性

9组OPs二元混合体系共45条射线的浓度-效应数据可用Weibull函数有效拟合，其拟合模型参数(回归参数α和β值，统计参数R2和RMSE)和每条射线的EC50及pEC50见表2，拟合CRCs绘于图3。由表2得知，R2均大于0.95，RMSE均小于0.06，拟合效果显著。大量污染物联合毒性研究表明，混合物毒性具有混合组分浓度比依赖性是常见现象[25-26]。从图3中可以看出，本研究除MIT-DIT、MIT-TRC、TRC-DIT、TRC-OMT和DDVP-DIT混合物体系的5条射线随组分的浓度比有较明显的变化外，其余4组OPs混合物体系的射线没有完全分开甚至重叠，表明不同OPs混合物对C. pyrenoidosa的联合毒性因组分的不同，有些混合物毒性具有组分浓度比依赖性，而某些混合物毒性则不存在组分浓度比依赖性。由于混合物毒性的复杂性，具体混合物中何种OPs存在可能使混合物毒性具有组分浓度比依赖性需要进一步研究。

2.3 OPs二元混合物的毒性相互作用

基于的95% OCI的CI法表征OPs混合物体系在5%～80%效应水平内对C. pyrenoidosa的毒性相互作用。图4示例了产生比较明显毒性相互作用的4组OPs混合体系的CI及OCI上下限随效应x%变化的曲线图。从图4可知，在MIT-DIT、MIT-OMT和MIT-DDVP混合体系中，不考虑95% OCI则整个效应水平内判断为拮抗作用，综合考虑95% OCI则低效应区呈加和作用，高效应区呈拮抗作用；MIT-TRC体系中，若不考虑95% OCI，射线R3(x%<50%)、R4(x%>20%)和R5(x%>15%)表现为协同作用，考虑95% OCI为加和作用，因此，在评估过程中有必要检查CI的95% OCI对混合物毒理学相互作用的影响。

该4组混合体系均含有MIT，并且其拮抗作用随MIT混合比的降低而逐渐过渡到加和作用，意味着表现出拮抗作用的4组混合体系中起决定性作用的是MIT，在对C. pyrenoidosa的致毒过程中MIT可能出现了不同的毒性效应或者类似竞争作用位点的可结合性降低，因而减弱了对方的毒性。从图中我们亦可以看出具有不同浓度比的不同混合射线具有不同的相互作用，不同效应水平下的相同混合射线具有不同的相互作用，这表明OPs混合物毒性相互作用具有一定的组分浓度比依赖性，进一步证实了文献中的研究结果[27-28]。

图4 4组具有毒性相互作用OPs二元混合物基于95% OCI的CI图注：● CI值；○ 95% OCI(95%观测置信区间)； ▏为相互作用分界线；ADD为加和作用；ANT为拮抗作用。Fig. 4 Plot of combination index (CI) integrating with 95% observation-based confidence intervals (OCIs) vs. 4 sets of OPs binary mixtureNote: ● CI value; ○ 95% OCI; ▏Interaction boundary; ADD stands for additive effect; ANT stands for antagonism.

所有OPs混合射线的毒性相互作用总结于表2，9组混合体系中有28条射线呈经典加和作用，17条射线呈部分加和，部分拮抗作用；发生拮抗作用的混合射线均具有低效应水平区域呈加和作用，高效应水平区域呈拮抗作用的规律。研究亦发现，具有毒性相互作用的MIT-OMT和MIT-DDVP混合体系的混合物毒性并没有明显的组分浓度比依赖性，混合毒性具有明显组分浓度比依赖性的TRC-DIT和TRC-OMT混合体系，其毒性相互作用均为加和作用。这说明OPs混合物的毒性相互作用组分浓度比依赖性与其混合物毒性的组分浓度比依赖性规律互不干扰，具体情况需进一步研究。

综上所述：

(1)根据单一毒性测试结果，本研究中5种OPs对C. pyrenoidosa的毒性差异不明显，其毒性大小顺序为：TRC(pEC50=3.89)>MIT(pEC50=3.77)>DDVP(pEC50=3.63)>OMT(pEC50=3.44)>DIT(pEC50=3.27)，OPs对C. pyrenoidosa的毒性大小受其中心磷原子的电正性影响。

(2)以基于95% OCI的CI法评估混合物毒性相互作用，OPs对C. pyrenoidosa的毒性相互作用以加和为主，部分发生拮抗作用，发生拮抗作用的混合射线具有低效应呈加和作用、高效应呈拮抗作用的规律；与MIT混合的体系均有发生拮抗作用，且MIT浓度比例越高，拮抗作用越强。

(3)OPs对C. pyrenoidosa的联合毒性因混合组分不同，部分混合物毒性依赖于组分浓度水平；OPs混合物的毒性相互作用与组分浓度比相关；OPs混合物对C. pyrenoidosa的毒性相互作用与其混合物毒性两者均存在的组分浓度比依赖性规律，且互不相关。