卢小亮，张 强，孙 渭，陈 鑫，吴洪启，陈耀锋*

1.西北农林科技大学农学院，陕西省杨凌示范区邰城路3 号 712100

2.中国烟草总公司陕西省公司，西安市曲江新区雁南四路21 号 710004

烟草赤星病（Tobacco brown spot）是由丝孢纲链格孢属链格孢菌（Alternaria alternata）引起的一种严重危害烟草生产的真菌性病害［1］，给烟草行业造成了巨大的经济损失。选育抗病品种和提高品种的抗病性是防治烟草赤星病最经济有效且利于环境保护的途径［2］。在抗烟草赤星病的传统育种中，大田人工病圃鉴定和离体叶片鉴定常作为抗病植株选择的主要方法。大田人工病圃鉴定主要用于烟草生长后期的接种鉴定，易受其他杂菌影响，历时长、耗费高，且气候条件不易控制，因此不能准确评价材料的抗病水平［3］。离体叶片鉴定是一种在烟草苗期进行的室内鉴定方法，相比大田人工病圃鉴定在很大程度上提高了鉴定效率，但在准确性方面不如病圃鉴定高［4］。病原菌毒素鉴定是一种新型抗病鉴定方法［5］。毒素的本质是病原菌产生的、有生物毒性的代谢产物。在一定条件下，病原菌毒素可使寄主植物产生特定的病症反应，病症反应的强弱与其寄主植物的抗病性具有高度相关性［6-7］。目前，病原菌毒素被用于作物抗病种质的筛选与鉴定。例如，广藿香青枯病［8］、棉花黄萎病［9］和烟草黑胫病［10］等病害的种质抗性鉴定，其效果能合理评价病菌寄主的抗性水平。烟草赤星病菌在培养过程中或侵染寄主后会在寄主体内产生一种寄主专化型毒素即AT-毒素［11］，该毒素在寄主体内主要通过破坏生物膜和影响生理代谢来引起病症反应［12］。郭永峰［13］以赤星病菌AT-毒素液处理烟草离体叶片，发现其发病程度与常规接种鉴定结果高度一致。

鉴于此，在前人研究的基础上，以4 种不同赤星病抗性的烟草品种为材料，进一步优化烟草赤星病病原菌产毒培养与AT-毒素的提取技术。采用培养基附加烟草赤星病菌AT-毒素的方法，通过不同AT-毒素浓度、不同胁迫时间，研究烟草赤星病菌AT-毒素对不同抗性烟草品种种子发芽特性的影响，筛选能有效鉴别烟草不同抗性的最佳AT-毒素浓度和胁迫时间，旨在建立一种高效、准确、广适的烟草赤星病离体胁迫抗性鉴定方法，为烟草赤星病抗病育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种均由中国烟草总公司陕西省公司提供。净叶黄（抗赤星病品种，R）、G28（中抗赤星病品种，MR）、YN116（中感赤星病品种，MS）和红花大金元（感赤星病品种，S）。供试菌株：烟草赤星病强致病力链格孢菌A1 号菌株，由中国农业科学院烟草研究所提供。于2017—2018 年在西北农林科技大学农学院细胞工程实验室进行实验。

1.2 方法

1.2.1 赤星病菌的活化、产毒培养与AT-毒素制备

菌种活化：用PDA 培养基对赤星病强致病力链格孢菌A1 号菌株进行接种活化。28 ℃避光培养4～7 d，以菌丝布满整个培养皿为宜［14］。

产毒培养与AT-毒素制备：参照郭永峰［13］制备AT-毒素原液的方法，用接种环取0.5 cm2已活化的赤星病菌菌饼，转入盛有250 mL 产毒培养液的三角瓶中，26 ℃回歇振荡培养21 d。经产毒培养后，将所得的培养液首先经无菌双层纱布过滤除去菌丝体，然后4 000 r/min 离心10 min 使孢子沉淀（此步骤重复2 次）。镜检无孢子后用0.22 μm 无菌滤器过滤除菌得到AT-毒素液，4 ℃冰箱保存。

PDA 培养基：去皮马铃薯200.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、琼脂18.00 g、水1 000 mL。

产毒培养液：蔗糖50.00 g/L、磷酸二氢钾1.00 g/L、硝酸钠2.00 g/L、硫酸镁0.50 g/L、氯化钾0.50 g/L、七水合硫酸亚铁0.01 g/L、酵母膏5.00 g/L、水1 000 mL。

1.2.2 AT-毒素原液中蛋白质和可溶性糖浓度的测定

采用考马斯亮蓝G-250 染色法［15］测定上述制备的AT-毒素原液中蛋白质的浓度，以牛血清蛋白为标准蛋白质。采用蒽酮比色法［15］测定AT-毒素原液中可溶性糖的浓度，以恒重葡萄糖为标准可溶性糖。

1.2.3 AT-毒素培养基的制备

AT-毒素培养基：MS 培养基（粉剂）［16］+30.0 g/L 蔗糖+6.5 g/L 琼脂+赤星病菌AT-毒素，pH 5.8。

制备方法：称取每200 mL AT-毒素培养基所需的MS 培养基、蔗糖、琼脂等基本成分，置于250 mL 三角瓶中，然后按体积分数加入已过滤除菌的赤星病菌AT-毒素液，用蒸馏水定容至200 mL，121 ℃灭菌20 min，均匀分装于3 个13 cm×13 cm的方形培养皿中。AT-毒素培养基的体积分数分别为0（CK）、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。

1.2.4 AT-毒素胁迫培养

分别挑选150 粒籽粒饱满、大小均一的不同烟草品种种子于2.0 mL 离心管中。在超净台上先用75%乙醇对种子消毒30 s，无菌水冲洗2 次，再用10%过氧化氢进行深层消毒8 min，然后用无菌水冲洗4 次［17］。将消毒好的4 个烟草品种种子分别接种到AT-毒素培养皿中，作为1 个处理，进行3 次重复。以不加赤星病菌AT-毒素的MS 培养基为空白对照。将培养皿置于（27±2）℃、3 000 ～4 000 Lx、光照16 h/黑暗8 h 条件下培养10、15、20 d。以发芽率和烟草种子根系扎进培养基的株数比率为鉴定指标，以筛选出能有效鉴别烟草不同抗性的最佳AT-毒素浓度和胁迫时间。

发芽率=发芽种子数/种子总数×100%

种子根系扎进培养基的株数比率=根系扎进培养基中的株数/发芽总株数×100%

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2010 和DPS 17.10 软件对试验数据进行处理，采用Duncan’s 新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 AT-毒素原液中蛋白质和可溶性糖的浓度

分别用考马斯亮蓝G-250 染色法和蒽酮比色法测定所制备AT-毒素原液中蛋白质和可溶性糖的浓度。结果表明，AT-毒素原液中蛋白质质量浓度为80.52 μg/mL，可溶性糖质量浓度为23.39 mg/mL。

2.2 AT-毒素胁迫对烟草种子发芽率的影响

由图1 可知，烟草赤星病菌AT-毒素胁迫处理对4 种烟草品种种子的发芽均有较大影响，随着AT-毒素浓度的增大，发芽率呈下降趋势。高浓度AT-毒素能显著抑制烟草种子的发芽，当AT-毒素浓度＞50%时，所有供试品种种子的发芽率均急剧下降。当在浓度为90%的AT-毒素培养皿中胁迫20 d 时，净叶黄和G28 仍表现出较高的耐受性，发芽率分别为51.39%和41.67%，显著高于YN116 和红花大金元。尽管不同烟草品种种子的发芽受AT-毒素影响较大，但随着胁迫时间的延长，不同品种之间发芽率的差异逐渐降低，因此无法以发芽率的高低来准确判定烟草品种对烟草赤星病的抗病水平。

图1 赤星病菌AT-毒素对烟草种子发芽率的影响Fig.1 Effects of AT-toxin from Alternaria alternata on germination rate of tobacco seeds

2.3 AT-毒素胁迫对烟草种子根系生长的影响

为进一步探究赤星病菌AT-毒素胁迫对烟草种子根系生长的影响，对各烟草品种种子在不同胁迫时间、不同胁迫浓度下根系扎进AT-毒素培养基中的能力进行分析。当AT-毒素浓度＞60%时，各品种烟草种子根系扎进AT-毒素培养基的株数比率均为0 或趋于0，因此结果未在表1 中列出。由表1 可知，在一定胁迫浓度下，不同烟草品种对赤星病菌AT-毒素的耐受力差异显著。在低浓度AT-毒素（浓度为0～20%）胁迫下，中感品种YN116 和感病品种红花大金元能克服AT-毒素的抑制作用，将根系扎入AT-毒素培养基；在高浓度AT-毒素（浓度为60%～100%）胁迫下，抗病品种净叶黄和G28 的抗性逐渐“丧失”。

表1 烟草种子根系扎进AT-毒素培养基中的株数比率Tab.1 Percentage of tobacco seedlings with roots’growing into AT-toxin medium

不同浓度AT-毒素胁迫对烟草种子根系生长的影响不同，根系扎进AT-毒素培养基中的株数比率随AT-毒素浓度的增大而降低。在50%AT-毒素胁迫第15 和20 d 时，抗病品种净叶黄的根系扎进培养基中的株数比率均最高，分别是G28、YN116、红花大金元根系扎进培养基中株数比率的1.18、1.75、6.02 倍和1.02、1.75、5.52 倍。因此，通过分析烟草种子根系扎进50%AT-毒素培养基中的株数比率，能够对不同烟草品种抗赤星病水平进行初步鉴定。

3 讨论

本研究中，发现赤星病菌AT-毒素胁迫对烟草种子的萌发具有一定的抑制作用，抑制效果的强弱与烟草品种对赤星病的抗性有关，与Ishida［18］用毒素液培养不同种质烟草细胞的结果一致。病菌毒素是抗病接种鉴定中最常用的试剂，确定最适浓度是鉴定、筛选抗病材料的关键［19］。本试验中，发现赤星病菌AT-毒素胁迫对烟草种子根系生长有显著影响，根系扎进培养基中的株数比率随AT-毒素浓度的增大而降低。表明在供试材料对不同浓度AT-毒素耐受范围内，选用高浓度AT-毒素可有效鉴定、筛选出抗赤星病的烟草品种，与高崇等［20］烟草菌核病的试验结果相似。

烟草赤星病抗病鉴定是烟草赤星病抗性育种和抗病分子机制研究的基础［21］。由于烟草赤星病的发病条件难以控制，所以其鉴定水平一直难以提高［22］。本研究中，通过简化赤星病菌AT-毒素的提取与检测技术，可在AT-毒素培养基中直接接种烟草种子进行鉴定。与现有技术相比，①直接利用种子进行赤星病菌AT-毒素胁迫的抗性鉴定，可大大缩短鉴定筛选周期；②避免从育苗移栽到成株期历时长、接种苗龄不一致、诱发条件受外界影响大等因素的影响；③AT-毒素胁迫鉴定成本极低，在实验室有限的条件下即可进行大批量的鉴定与筛选。尽管AT-毒素胁迫鉴定较传统鉴定方法表现出种种优势，但其存在的局限性仍不可忽视。首先其诱发的病变只是有毒物质对植物组织和细胞的短期伤害，不能形成再侵染，与实际病害有本质区别；其次鉴定结果的准确性还受种子活力的影响。因此，在实际应用中AT-毒素胁迫鉴定可作为一种前期抗性筛选的重要手段，而品种最终的抗性评价还需结合其他的鉴定结果来确定。

4 结论

①赤星病链格孢菌A1 号菌株经活化、产毒培养后，获得含蛋白质80.52 μg/mL、可溶性糖23.39 mg/mL 的AT-毒素原液。②烟草赤星病菌AT-毒素胁迫处理对4 种烟草品种种子的发芽均有较大影响，高浓度AT-毒素能显著抑制烟草种子的发芽。③利用50%的赤星病菌AT-毒素胁迫15～20 d时，抗、感品种烟草种子根系在AT-毒素培养基上扎进培养基中的株数比率差异显著。