康兆颜， 白 洁,2， 郭晓旭， 陈 琳， 胡春辉， 李岿然

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100； 2.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100； 3.青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛 266109；4.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

纳米技术的迅速发展引起众多领域发生革命性变化，随着纳米产品种类和数量的逐年递增，释放到环境中的纳米材料量也逐渐增多，严重威胁生态环境和人类健康，因此纳米材料的安全性近年来受到国内外众多学者的广泛关注[1]。ZnO-NPs因其同时具有纳米材料和传统氧化锌材料的双重特性，在纺织工业、化妆品、工业涂层、医学抗菌和水处理等领域中被广泛的应用[2-4]，导致其被加速释放到水环境中。由于纳米材料具有颗粒小、表面积大的特点，与其他材料相比具有更大的表面活性和迁移性能，因此其毒性与常规尺寸的物质不同或毒性效应更大[5]，且ZnO-NPs比其他金属氧化物纳米颗粒(如TiO2、SiO2、CuO等)的毒性更大[6-7]。

海洋作为各种污染物质的最终归趋地，纳米材料将不可避免地通过各种途径进入海洋环境，人类利用海水进行水产品养殖等活动时产生的高盐含氮废水中也会含有纳米材料。据报道，ZnO-NPs被频繁检测到存在于污水处理系统中[8-9]，自然水体中ZnO-NPs颗粒的总量在1～100 μg·L-1之间，但由于污水处理系统的过滤、沉淀功能以及纳米颗粒易吸附在生物活性污泥表面等性质，导致污水处理系统中纳米颗粒浓度累积达到mg·L-1的水平[10]。纳米颗粒的累积会影响海水养殖污水处理系统中脱氮细菌的正常生长代谢，从而导致水处理生物脱氮效率下降，影响海水养殖废水的循环利用及排放，最终会对海洋生态系统造成危害[9]，其中河口地区污染尤为严重[11]。

1 材料与方法

1.1 ZnO-NPs的表征及悬浊液制备

本研究中ZnO-NPs购自美国Sigma-Aldrich公司，纯度>99.7%，直接取样用于观察表征ZnO-NPs的形态；为制备悬浊液，取500 mg ZnO-NPs分散于100 mL经高温灭菌的去离子水中，使用前室温下超声3 h，现用现配。

1.2 菌株来源及培养基

微量元素溶液(g·L-1)：Na2EDTA 63.70；CaCl25.50；ZnSO42.20；MnCl2·4H2O 5.06；FeSO4·7H2O 5.0；CoCl2·6H2O 1.61；Na2MoO4·4H2O 1.10；CuSO4·5H2O 1.57。

1.3 ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1的短期暴露实验

1.4 测定方法

LDH使用南京建成生物公司的LDH试剂盒来检测，取适量菌液1 000 r·min-1离心5 min，取上清液并逐步添加试剂后，使用酶标仪(Multiskan Spectrum)在450 nm波长下测定样品。

ROS使用南京建成生物公司的活性氧试剂盒来检测，取适量菌液加入适量的ROS探针DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)，在细菌培养相同条件下培养30 min 后，1 000 r·min-1离心10 min收集菌体，用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤菌体2次，使用流式细胞仪(AccuriTM C6 Plus Flow Cytometer)在最佳激发波长485 nm、最佳发射波长525 nm下进行样品测定。

1.5 数据分析

采用SPSS Statistics统计软件进行T检验差异性分析，当P<0.05时表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 ZnO-NPs的形态表征

经透射电子显微镜扫描分析显示(见图1)，ZnO-NPs颗粒形态呈不规则杆状，粒径较不均匀，但粒径均低于100 nm，有研究发现[25-27]，颗粒尺寸会影响ZnO-NPs的毒性，尺寸越小，比表面积越大，暴露于颗粒表面的活性位点越多，颗粒的表面活性越强，ZnO-NPs的毒性也越强；其颗粒间存在不同程度的团聚，因此后续实验中使用ZnO-NPs时，都使用超声分散仪进行分散，以有效缓解其团聚现象。

2.2 不同浓度ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1形态结构的影响

细菌表面一般带有负电荷，带正电荷的ZnO-NPs和细菌间可能产生较强的静电引力，使其更容易吸附到细菌表面，直接与细菌接触[28]。纳米颗粒吸附在细菌表面会磨损细胞壁、损伤细胞膜，同时由于ZnO-NPs颗粒体积微小，可能堵塞细菌细胞膜上的各种运输通道，导致细胞膜渗透性增加，引起细菌细胞破裂等，一部分ZnO-NPs颗粒还可能进入细胞内[29]，进一步造成菌体形态结构的损伤。

图1 ZnO-NPs透射电镜图Fig.1 TEM image of ZnO-NPs

菌株Halomonassp. KGL1在不同浓度ZnO-NPs暴露24 h后的形态如图2所示，对照组菌体为短杆状且形态饱满分散(见图2(a))，随着ZnO-NPs浓度的升高，菌体发生不同程度的团聚和损伤。ZnO-NPs浓度为1 mg·L-1时菌体表面即开始出现粘连现象，发生小规模团聚，但没有明显的损伤产生(见图2(b))。随着ZnO-NPs浓度升高到10和50 mg·L-1时，菌体出现大规模团聚和粘连现象，菌体开始出现损伤，浓度为10 mg·L-1时少部分菌体发生凹陷(见图2(c))，浓度为50 mg·L-1时菌体损伤严重，较多的菌体出现凹陷和破碎现象(见图2(d))。结果表明ZnO-NPs浓度越高，对该菌株形态结构的影响越显著。有研究通过透射电子显微镜观察到ZnO-NPs可导致污水生物处理系统中的典型氨氧化菌Nitrosomonaseuropaea(N.europaea)的细胞形态发生改变、细胞膜受到损伤，并呈现显著的浓度抑制效应[20-21,30]，其结果与本研究相似。

2.3 不同浓度ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1细胞膜完整性的影响

细胞膜作为细胞接触外界的第一道屏障，可以维持细胞内稳定的代谢环境，同时调节和选择进出细胞的营养物质。LDH是一种细胞溶质酶，在正常情况下，不能透过细胞膜，当细胞膜发生损伤时，LDH即会释放到细胞外，因此可以通过对LDH释放率的分析推测出菌株Halomonassp. KGL1细胞膜的完整性[31]。

以对照组LDH释放率为100%，计算该菌株在不同浓度ZnO-NPs暴露24 h后LDH的释放率。如图3所示，随ZnO-NPs浓度的增加，LDH释放率呈上升趋势。当ZnO-NPs浓度为1和10 mg·L-1时，LDH释放率分别为118%和136%，在这两种浓度下ZnO-NPs对菌株细胞膜完整性无显著影响(P>0.05)；当ZnO-NPs浓度为50 mg·L-1时，LDH释放率为372%，显著高于对照组(P<0.05)，表明该菌株在此暴露浓度下细胞膜完整性受到严重破坏，导致菌体形态结构发生显著变化，与扫描电镜(见图2(d))的结果一致。已有研究发现8 mg·L-1的ZnO-NPs会导致大肠杆菌细胞产生LDH，并且使细胞膜渗透性明显増强[32]，与之相比，本研究中菌株相对更加敏感，1 mg·L-1的ZnO-NPs即会导致该菌株的细胞产生LDH，改变菌株细胞膜的粘滞性。

((a)0 mg ·L-1；(b)1 mg ·L-1；(c)10 mg ·L-1；(d)50 mg ·L-1)

图2 ZnO-NPs对Halomonassp. KGL1形态的影响
Fig.2 Impacts of ZnO-NPs on morphology ofHalomonassp. KGL1

(*表示与对照组相比，两组间差异显著，下同。* indicates that there is a significant difference between the two groups compared with the control group, the same below.)

图3 ZnO-NPs对LDH释放的影响
Fig.3 Impacts of ZnO-NPs on LDH production

2.4 不同浓度ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1活性氧的影响

ROS是一类含氧活性分子的总称，主要有3种类型：超氧阴离子(O2-)，过氧化氢(H2O2)以及羟自由基(·OH)，细菌体内代谢过程会产生少量ROS，在外源环境的胁迫下则会产生过多ROS[33]。

以对照组中ROS产生率为1，研究菌株Halomonassp. KGL1在不同浓度ZnO-NPs暴露24 h后ROS的产生情况(见图4)。ZnO-NPs胁迫会使该菌株细胞产生ROS，且随ZnO-NPs浓度的增加，ROS产生量越高。当ZnO-NPs浓度为1和10 mg·L-1时，检测到ROS含量分别为对照组的1.11和1.27倍(P>0.05)，且菌株细胞膜未发生显著损伤，表明在这两种浓度下ZnO-NPs未诱导菌株细胞发生明显的氧化应激效应；当ZnO-NPs浓度为50 mg·L-1时，检测到ROS含量为对照组的2.76倍(P<0.05)，ROS产生量显著增大，在此浓度下菌株细胞氧化应激效应显著，从而导致菌体严重损伤(见图2(d))，产生该结果的原因可能与细胞膜被破坏(见图3)导致ZnO-NPs进入菌株细胞有关。结果表明ZnO-NPs对该菌株的生物胁迫效应除直接作用于菌株表面外，也与菌株细胞内ROS水平变化密切相关。

图4 ZnO-NPs对ROS释放的影响Fig.4 Impacts of ZnO-NPs on ROS production

2.5 不同浓度ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1生长的影响

菌株细胞损伤会影响菌株的生长，不同浓度ZnO-NPs对菌株Halomonassp. KGL1生长的影响如图5所示。菌株在不同浓度ZnO-NPs暴露初期OD600值的变化趋势一致，但暴露8 h后不同浓度组的菌株生长速率开始出现差异，ZnO-NPs浓度越高，菌株生长速率越慢，OD600值越低。当ZnO-NPs浓度为1 mg·L-1时，菌株的OD600值变化趋势较对照组无显著差异(P>0.05)；当菌株在ZnO-NPs浓度为10、50 mg·L-1的培养基中培养24 h后，OD600值分别为1.82和1.36，分别较对照降低19%和43%(P<0.05)，生长速率受到显著抑制。由此可见，ZnO-NPs浓度越高，对该菌株生长的抑制程度越强，产生该结果的原因可能与高浓度ZnO-NPs导致细胞结构破坏并产生大量ROS有关。

2.6 不同浓度ZnO-NPs对Halomonas sp. KGL1脱氮能力的影响

图5 ZnO-NPs对菌株生长的影响Fig.5 Impacts of ZnO-NPs on growth of Halomonas sp. KGL1

图6 ZnO-NPs对去除率的影响Fig.6 Impacts of ZnO-NPs on removal efficiency of

图7 ZnO-NPs对去除率的影响Fig.7 Impacts of ZnO-NPs on

图8 ZnO-NPs对累积量的影响Fig.8 Impacts of ZnO-NPs on accumulation amount of

3 讨论

目前关于纳米材料对细菌毒性机制的研究主要集中在细胞膜损伤和氧化胁迫两个方面[21]，其中ROS的产生等对生物体的氧化胁迫目前被认为是导致纳米材料生物胁迫效应的主要方式[34-36]。ZnO-NPs等纳米材料可与细菌细胞直接接触，并吸附在细菌细胞膜表面[12]，进而改变细胞膜粘滞性和细胞膜渗透性，此外，ROS的产生也可能会损伤细菌细胞膜[37-39]，细胞膜的损伤导致细菌细胞形态发生改变并且损伤细胞功能，甚至导致细胞死亡[40-41]。本研究通过扫描电镜的观察研究以及对LDH的测定发现，ZnO-NPs会破坏菌株Halomonassp. KGL1的细胞膜，改变菌株细胞膜粘滞性，从而导致菌株细胞发生团聚，菌体形态结构发生变化，其中50 mg·L-1的ZnO-NPs对菌株细胞影响最为显著。细胞膜被破坏可能导致ZnO-NPs进入细菌细胞诱导其发生氧化应激效应，细胞内氧化与抗氧化作用失衡造成细胞内ROS累积[42]，过量ROS会导致细胞中DNA、脂质、蛋白质等分子过度氧化，脂质过氧化会引起机体一系列代谢反应的失常和免疫功能降低，损害生物膜及其功能，对细胞造成进一步损伤[32]。已有研究者[15,21-22,34,37]发现ZnO-NPs导致细菌细胞膜完整性被破坏、细菌浓度、脱氮速率降低的原因可能与ZnO-NPs诱导细胞内ROS大量产生密切相关。本研究中，ZnO-NPs能够诱导菌株Halomonassp. KGL1细胞发生氧化应激效应产生ROS，且ROS的产生量与ZnO-NPs浓度呈正相关关系，50 mg·L-1的ZnO-NPs诱导菌株细胞产生大量ROS，并且在该浓度下菌株生长和脱氮过程受胁迫程度最强。

综上所述，当海水养殖污水处理系统中ZnO-NPs浓度低于10 mg·L-1时，菌株Halomonassp. KGL1在该环境中受胁迫程度较小，其在处理此类高盐含氮废水时仍可以发挥高效的脱氮能力，并且当ZnO-NPs浓度低于1 mg·L-1时，对菌株Halomonassp. KGL1的影响是可以忽略不计的。鉴于纳米材料应用的日趋广泛性与潜在的安全性问题, 不同纳米材料对菌株Halomonassp. KGL1的生物胁迫效应需要继续探究。

4 结论

(1) ZnO-NPs对菌株Halomonassp. KGL1的生物胁迫除直接作用于菌体表面破坏菌株细胞细胞膜和形态结构外，也与菌株细胞内ROS水平密切相关。

(2) ZnO-NPs浓度为1 mg·L-1时对菌株Halomonassp. KGL1无显著影响，浓度为50 mg·L-1时对菌株Halomonassp. KGL1抑制作用显著，各生物胁迫效应强度均随ZnO-NPs浓度的升高而增大。