林志雄 鱼海琼 王莹 翟建新 张利

摘要：通过比对NCBI上马流感H3N8序列，针对HA和NA基因序列高度保守区域设计了特异性强的引物与探针，优化了程序，建立了以实时荧光RT-PCR技术检测马流感H3N8的方法。结果表明，该方法最小检测浓度为3.36×102 copies/μL;特异性强，仅针对马流感H3N8样本检出为阳性;对58份临床样本的检测，阳性检出率为12.07%，是常规PCR的2.3倍，且与病毒分离100%符合。

关键词：马流感病毒;H3N8亚型;实时荧光RT-PCR

中图分类号：Q789;S852.65         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）17-0129-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.17.034           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： By comparing the H3N8 sequence of Equine influenza virus （EIV） from NCBI， highly specific primers and probes were designed for the highly conserved region of HA and NA gene sequences， and the program was optimized to establish a RT-PCR method for the detection of EIV H3N8. The results showed that the minimum detection concentration was 3.36×102 copies/μL. With high specificity， only EIV H3N8 samples were positive. The positive detection rate of 58 clinical samples was 12.07%， 2.3 times that of conventional PCR， and 100% consistent with virus isolation.

Key words： Equine influenza virus（EIV）; H3N8 subtype; RT-PCR

马流感病毒（Equine influenza virus，EIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，其基因组由8股负链RNA构成，包括神经氨酸酶（HA）基因、血凝素（NA）基因、核蛋白（NP）基因、基质蛋白（M）基因、聚合酶碱性蛋白1（PB1）基因、聚合酶碱性蛋白2（PB2）基因、聚合酶酸性蛋白（PA）基因和非结构蛋白（NS）基因[1]，其中HA基因与NA基因在流感中变异最为频繁，亚型众多。到目前为止，马流感仅有H7N7和H3N8两种亚型[1]。

H3N8亚型流感是马属动物呼吸道疫病的主要原因，发病率高，致死率较低，但常造成较大的经济损失，马流感亦极有可能与其他流感发生重组。目前临床上检测马流感的方法较多，有病毒分离、血凝抑制试验，基于血清学的ELISA，也有基于核酸检测的核酸扩增技术，相比之下核酸扩增的效率更高，实时荧光定量的方法由于综合性能强，检测速度快，灵敏度高，操作简单，使用便利，并已得到大量广泛的使用[2]。为此，本研究针对马流感H3N8 HA和NA基因序列高度保守区域设计了特异性强的引物与探针，拟建立以实时荧光RT-PCR技术检测马流感H3N8的方法，以期为后续产品商品化提供理论和研究基础。

1  材料与方法

1.1  材料

禽流感H5N1、H5N6、H7N9各5份，人流感H3N2、 H1N1各5份，马流感H3N8 5份，临床采集到马鼻咽喉拭子共58份。由于试验所用的病毒株涉及保存条件要求和样本信息保密性，故病毒株测试试验主要在广东省疾病预防控制中心和深圳市疾病预防控制中心实验室完成;临床样本测试试验在深圳市疾病预防控制中心实验室完成。

仪器和试剂：7500型荧光PCR仪购自ABI公司，探针引物由Takara合成，pMD 18-T载体购自Takara，荧光PCR试剂购自美国VitaNavi公司。

1.2  方法

1.2.1  引物设计  从NCBI上下载马源宿主H3N8亚型流感HA和NA基因序列，分离地点包括中国、日本、中国香港、印度等地。应用Lasergene软件分别比对HA和NA基因序列的保守區域和SNP特性，使用在线网站weblogo3对引物及探针进行特殊结构分析，NCBI BLAST进行比对最终确定引物及探针。所设计出的H3N8引物探针特异性检测马流感H3N8亚型，而对其他亚型无检出。本研究中所确定的马流感H3N8引物探针序列信息见表1。

1.2.2  阳性质粒制备  通过比对马流感H3N8序列，选择含有HA和NA基因序列区域合成质粒片段，并将该片段与pMD 18-T载体相连接转化至工程菌大肠杆菌DH5α中，通过氨苄蓝白斑筛选转化成功的大肠杆菌，通过PCR以及酶切测序鉴定目的片段，合格后抽提质粒制备阳性对照。

1.2.3  荧光PCR扩增  反应体系为25 μL，包括2×Omnitaq PCR buffer 12.5 μL，35 mmol/L dUTPs 0.5 μL，Enzyme Combo LA 2 μL，Cesium Taq LA DNA Polymerase 1 μL，H3上游 primer（400 nmol/L） 0.1 μL，H3下游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8上游primer（400 nmol/L） 0.1 μL，N8下游primer（400 nmol/L）0.1 μL，核酸5 μL和ddH2O 3.6 μL。