王桂燕, 吴沁霏, 张 平, 倪 倩, 张 驰, 迟艳玲, 肖 月

(沈阳药科大学 制药工程学院, 辽宁 沈阳 110016)

对二氯苯(1,4-dichlorobenze,P-DCB)是重要的有机化工原料,质量好的P-DCB在各项新的工业和经济生活领域中有着广阔的应用和发展前途.P-DCB具有高度的脂溶性,能够穿过包括胎盘屏障和血脑屏障在内的各种生物膜,1987年它被国际癌症研究机构(IARC)确定为可能的人类致癌物,在水生生物中可发生生物蓄积. 重金属镉(Cd2+)被广泛应用于各种工农业生产中,由此产生的大量含镉离子的废水给土壤和水资源带来严重污染[1-2].现在有多种污染物共同存在于环境中[3-4].因此,多种污染物之间的复合污染应该更加受到人们的关注.在生活中广泛使用的P-DCB和重金属Cd2+常常同时存在于水环境中且易构成复合污染.对于二者复合污染胁迫鱼类导致对其抗氧化酶系统的影响至今尚未见有报道.因此,我们用草鱼作研究对象,考察草鱼肝胰脏和肾脏组织的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)在P-DCB 和Cd2+的联合胁迫下的变化情况,并详细探讨了用SOD和POD的酶活变化来作为P-DCB和Cd2+联合污染生物指标的可能性,为防治水环境的污染、保护水生生物的正常生长提供科学依据.

1 实验部分

1.1 试验材料、试剂和仪器

试验鱼苗选购于沈阳北市花鸟批发市场.挑选鳞片无缺口、行动敏捷、大小相近的鱼,体长不大于5 cm,体重在 4.5 g左右.购回后投入大水族缸里,全天曝气,驯养7 d(在此时间段死亡率不能超过5%).

对二氯苯,纯度>97%,购于山东西亚化学工业有限公司,氯化镉(CdCl2·2.5 H2O)、硝基蓝四氮唑(NBT)、愈创木酚、L-甲硫氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、核黄素、磷酸二氢钠和磷酸氢钠等都是分析纯试剂,购于沈阳禹王化学试剂公司.

CR-GIII离心机(HITACHI),UV1902PC分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司),HM-330培养箱(上海一恒科技有限公司),Seven2Go便携式溶解氧仪(METTLER TOLEDO),空气压缩机.

1.2 实验步骤与方法

采用静态试验法[5].实验用水是已曝气3 d的自来水.水温为18 ℃左右,pH值为6.6±0.1,溶解氧质量浓度(ρ)大于5.0 mg·L-1.试验使用大小为25 cm×18 cm×25 cm的水族缸.试验过程中定期测试溶液的温度(T)、pH值、ρ等.在试验期间一直曝气,整个试验期间和试验的前一天都不投食.

1) 试验质量浓度设计.在P-DCB和Cd2+联合污染试验基础上,得到的联合毒性各污染物96 h的LC50值作为一个毒性单位(TU)[6],然后以毒性1∶1进行复合毒性试验,设置0.5 TU、0.25 TU、0.125 TU和0.062 5 TU 4个质量浓度组,各质量浓度分别设3个平行组和1个空白对照组,每组随机投入10尾鱼.

表1 P-DCB和Cd2+ 复合毒性试验质量浓度水平的设定

2) 酶活性测定.P-DCB和Cd2+联合污染试验每隔1 d更换1次新制的试验液.在试验后的第1、2、3、4、5、6和7 d分别从染毒组和空白组中随机取出3条草鱼,迅速解剖,取出草鱼的肝胰脏和肾脏,然后在含有0.1 mmol·L-1的EDTA、pH值为7.8的提前冷藏的磷酸盐缓冲溶液(50 mmol·L-1)里匀浆,再把得到的匀浆液离心30 min(4 ℃、15 000 r·min-1),离心后的上清液就是酶提取液,在4 ℃下保存以备用.采用氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性[7],引起3.0 mL反应液达到50%抑制时所需要的酶量定义为1个酶活性单位(U),1 U=16.67nkatal.用U·g-1表示SOD酶活性,采用愈创木酚法测定POD活性[8],吸光度在470 nm处变化0.01表示1个酶活力单位(IU),用IU·(g·min)-1表示POD酶活性,组织的质量都是鲜重.

1.3 数据处理

试验数据用SPSS 22.0软件进行单因素分析,数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示,用LSD多重比较来分析试验结果的差异显著性,p<0.05表示显著性差异.

2 实验结果与讨论

2.1 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶的影响

如图1所示,24 h内各污染质量浓度草鱼肝胰脏超氧化物歧化酶活性抑制现象均很显著(p<0.05);当污染暴露达到48 h时,0.062 5 TU和0.125 TU组肝胰脏的SOD被明显诱导(p<0.05);随着暴露时间的继续增加,高质量浓度组草鱼肝胰脏的SOD活性被明显诱导(p<0.05);当暴露时间达到120 h,肝胰脏的SOD活性在各污染质量浓度组中均被明显诱导(p<0.05);当暴露144 h时,肝胰脏的SOD活性在各污染质量浓度组中都有所下降,但只有在0.25 TU组的草鱼肝胰脏SOD酶活明显低于对照(p<0.05),其他组SOD酶活仍明显高于空白对照组(p<0.05);污染暴露时间增加到168 h,各质量浓度组的SOD活性抑制现象均比较明显(p<0.05).各质量浓度组中草鱼肝胰脏组织的SOD酶活随着 P-DCB和Cd2+联合污染时间的延长呈现出先降再升又降的趋势.

图1 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肝胰脏SOD酶活的影响Fig.1 Effects of P-DCB and Cd2+ on the SOD activity in liver pancreas tissues of grass carp

注: 不同大写字母表示同一质量浓度不同暴露时间之间存在显著性差异(P<0.05),不同小写字母表示同一暴露时间不同质量浓度之间存在显著性差异(P<0.05).下同

2.2 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肾脏超氧化物歧化酶的影响

如图2所示,草鱼肾脏组织的SOD酶活在暴露24 h内被明显抑制(p<0.05);较低质量浓度组肾脏组织SOD活性在污染48 h被明显诱导(p<0.05);各污染暴露的质量浓度在暴露72 h时,草鱼肾脏SOD活性都被明显抑制(p<0.05);当P-DCB和Cd2+联合污染时间达到96 h,除了最低质量浓度组的SOD酶活抑制现象比较明显(p<0.05)以外,其他质量浓度组的SOD酶活均被明显诱导(p<0.05);草鱼肾脏组织SOD酶活随着P-DCB和Cd2+联合污染时间的继续延长,低质量浓度组被诱导显著(p<0.05),而高质量浓度组被明显抑制(p<0.05);当污染达到168 h,各暴露质量浓度组的草鱼肾脏SOD酶活都被明显被抑制(p<0.05).

图2 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肾脏SOD酶活的影响

2.3 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肝胰脏POD酶活的影响

如图3所示,草鱼肝胰脏POD酶活在24 h内各污染的质量浓度组抑制现象明显(p<0.05);在污染48 h时, 0.25 TU组肝胰脏POD活性被明显诱导(p<0.05),而其他污染质量浓度组POD活性则被抑制比较明显(p<0.05);0.062 5 TU组肝胰脏POD活性在污染72 h时被诱导比较显著(p<0.05),其他污染质量浓度组POD活性则被抑制比较显著(p<0.05);当暴露时间达到96 h以上时,各暴露质量浓度组中草鱼肝胰脏POD活性抑制现象均非常显著(p<0.05).

2.4 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肾脏POD酶活的影响

如图4所示,较低质量浓度组草鱼肾脏POD活性在24 h内被明显诱导(p<0.05),而高质量浓度组POD活性则被明显抑制,其值显著低于对照组(p<0.05);当污染时间达到48 h时,0.5 TU组的POD活性被明显诱导(p<0.05);污染暴露达到72 h时,0.5 TU组的POD活性与对照组没有明显差异(p>0.05),而其他质量浓度组肾脏POD活性均被明显诱导(p<0.05);当P-DCB和Cd2+联合污染到96 h时,0.5 TU质量浓度组的肾脏POD活性抑制现象比较明显(p<0.05);污染暴露到120 h时,较低质量浓度组草鱼肾脏POD活性被诱导比较显著(p<0.05),而最高浓度组POD活性则出现显著的抑制现象(p<0.05);污染达到144 h以上时,各污染质量浓度组草鱼肾脏POD活性均明显低于空白对照组(p<0.05).

图3 P-DCB和Cd2+联合污染对草鱼肝胰脏POD酶活的影响

图4 P-DCB和Cd2+复合污染对草鱼肾脏POD酶活的影响Fig.4 Effects of combined exposure of P-DCB and Cd2+ on POD enzyme activity in kidney tissues of grass carp

3 结 论

1) P-DCB和Cd2+复合污染对草鱼肝胰脏和肾脏组织的酶活影响显著.在P-DCB和Cd2+联合作用下,草鱼肝胰脏和肾脏组织的POD和SOD酶活均变化比较明显,随着污染时间的增加都呈现出“降-升-降”的趋势.当污染时间增加到168 h,各质量浓度组的肝胰脏SOD均明显低于空白对照组(p<0.05);当污染时间增加到120 h以上,0.25 TU和0.5 TU组的草鱼肾脏SOD酶活明显低于对照组(p<0.05);草鱼肝胰脏POD只有在0.062 5 TU和0.25 TU组分别在暴露72 h 和48 h时明显高于对照组(p<0.05),其他情况下始终显著低于对照组(p<0.05);当污染暴露时间达到144 h以上,各质量浓度组肾脏组织的POD酶活均明显低于对照组(P<0.05).

3) 草鱼肝胰脏和肾脏组织SOD活性不稳定有待深入研究.在P-DCB和Cd2+复合污染对草鱼肝胰脏SOD活性的影响中,0.125 TU组和0.25 TU组SOD酶活性分别在72 h和96 h出现波动,另外肾脏组织SOD酶活在0.062 5 TU组和0.125 TU组在暴露48 h也有波动,其原因都有待继续深入研究.另外在P-DCB和Cd2+复合污染对草鱼肾脏POD活性的影响中,0.062 5 TU组也出现波动,这些不稳定的原因也需要进一步深入研究.