黄良永，杨玲风，甘春英，郑江萍

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部，十堰 442000；2.湖北医药学院药学院，十堰 442000)

如意金黄散是中药复方制剂，处方出自陈实功的《外科正宗》，由天花粉、大黄、姜黄、黄柏、白芷、生天南星、厚朴、陈皮、苍术、甘草等10味中药组成。该药为2015年版《中华人民共和国药典》一部收录品种，临床使用广泛，具有清热解毒、消肿止痛作用，用于热毒瘀滞肌肤所致疮疡肿痛、丹毒流注，症见肌肤红、肿、热、痛，亦可用于跌打损伤。外用于红肿、烦热、疼痛时用清茶调敷；用于漫肿无头症状时用醋或葱酒调敷，亦可用植物油或蜂蜜调敷，一日数次[1]。《中华人民共和国药典》2015年版采用薄层色谱法对大黄、黄柏、厚朴、甘草、白芷药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱(HPLC)法对姜黄中的姜黄素进行定量测定。文献报道[2-10]如意金黄散含量测定方法均采用HPLC法，测定指标成分有姜黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、厚朴酚、和厚朴酚等，结果表明不同厂家如意金黄散指标成分含量差异显著。因此，采用测定中药复方制剂中单一指标成分或多个指标成分含量的方法来控制质量有一定局限性，不能满足全面质量控制的需求。为考察如意金黄散质量稳定性，探索一种全面控制其质量的方法，笔者参考有关文献[1-12]，应用HPLC梯度洗脱法，建立了如意金黄散HPLC指纹图谱测定方法，绘制了10批样品色谱图，得到其特征指纹图谱，能够较全面地反映处方中原药材所含化学成分的种类与数量，可以对如意金黄散药品质量进行整体描述和评价，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 DIONEX Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国Thermo公司，四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器DAD、柱温箱)；Chromeleon色谱工作站；色谱柱：Waters XTerra MS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；KM-340超声清洗机(广东科盟电器有限公司，可调功率，40 kHz)；AUW 120D电子分析天平(日本岛津公司，感量：0.01 mg)。

1.2试药 橙皮苷对照品(批号：MUST-15070211，含量：99.70%)、甘草苷对照品(批号：MUST-15082811，含量：98.50%)、大黄素对照品(批号：MUST-16110712，含量：99.48%)、大黄酚对照品(批号：MUST-16031603，含量：99.01%)由中国科学院成都生物研究所与成都曼思特生物科技有限公司提供；甘草酸对照品(批号：110731-201418，含量：93.10%)、小檗碱对照品(批号：110713-200609，含量：100%)、黄柏碱对照品(批号：MUST-16040612，含量：99.29%)、苍术素对照品(批号：111924-201303，含量：99.50%)、厚朴酚对照品(批号：110729-200412，含量：100%)、姜黄素对照品(批号：110823-201004，含量：98.80%)、芦荟大黄素对照品(批号：110795-201007，含量：98.00%)、大黄酸对照品(批号：110757-200206，含量：100%)、大黄素甲醚对照品(批号：110758-201415，含量：99.80%)由中国食品药品检定研究院提供。如意金黄散10批(批号：S1～S10)均由太和医院制剂室生产。乙腈、甲醇为色谱纯(德国默克公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1如意金黄散的制备 处方：天花粉320 g、大黄160 g、姜黄160 g、黄柏160 g、白芷160 g、天南星64 g、厚朴64 g、陈皮64 g、苍术64 g、甘草64 g。制备方法：取方中药材，粉碎成细粉，过筛孔内径150 μm (100目)筛，混匀即得。

2.2HPLC色谱图的绘制

2.2.1色谱条件 Waters XTerra MS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为 0.1%磷酸溶液，按表1规定进行梯度洗脱；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速1.0 mL·min-1，理论板数以甘草酸计应不低于5000。

表1 洗脱梯度程序

2.2.2样品溶液的制备

2.2.2.1对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品20 mg，甘草酸对照品10 mg，甘草苷对照品1 mg，小檗碱对照品5 mg，黄柏碱对照品5 mg，苍术素对照品1 mg，厚朴酚对照品2 mg，姜黄素对照品0.5 mg，芦荟大黄素对照品0.8 mg，大黄素对照品0.8 mg，大黄酸对照品0.8 mg，大黄酚对照品0.8 mg，大黄素甲醚对照品0.4 mg，分别置于50 mL量瓶，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，即得对照品溶液。

2.2.2.2供试品溶液的制备 取10批(批号：S1～S10)如意金黄散，各2 g，分别置于三角烧瓶，精密加入70%甲醇50 mL，放置0.5 h，称定质量，超声处理45 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方配比分别称取10味药材，天花粉0.5 g、大黄0.25 g、姜黄0.25 g、黄柏0.25 g、白芷0.25 g、天南星0.1 g、厚朴0.1 g、陈皮0.1 g、苍术0.1 g、甘草0.1 g，分别置于三角烧瓶，精密加入70%甲醇50 mL，放置0.5 h，称定质量，超声处理45 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得10个药材的对照溶液。

2.2.3色谱适应性实验 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、药材对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在“2.2.1”项色谱条件下，如意金黄散供试品溶液色谱图在对照品色谱相同的位置有甘草酸、苍术素、厚朴酚、姜黄素、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚峰，各成分峰与其相邻峰完全分离，理论塔板数以甘草酸的峰计大于5000，见图1和图2。与如意金黄散的色谱图比较10种药材对照溶液的色谱图分别有相应的峰，见图3，通过比较色谱峰保留时间，初步判定如意金黄散色谱图中的主要色谱峰的原药材归属，除制南星药材外，其他药材均有与如意金黄散的色谱图相对应的色谱峰，少量色谱峰在原药材色谱图中无法归属。

图1 供试品溶液HPLC色谱图

2.3指纹图谱方法学考察

2.3.1精密度实验 取同一供试品溶液(批号：S5)，按“2.2.3”项方法连续进样5次，每次10 μL，记录色谱图，测定21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果21个共有峰相对保留时间RSD均<0.40%，相对峰面积RSD均<0.71%(n=5)，结果表明，仪器精密度好。

2.3.2重复性实验 取同一批供试品(批号：S5)，按“2.2.2.2”项方法制备供试品溶液6份，按“2.2.3”项方法进样测定并分别测定其色谱图，结果其相对保留时间稳定，21个共有峰相对保留时间RSD<0.49%。

1.橙皮苷；2.甘草酸；3.甘草苷；4.小檗碱；5.黄柏碱；6.苍术素；7.厚朴酚；8.姜黄素；9.芦荟大黄素；10.大黄素；11.大黄酸；12.大黄酚；13.大黄素甲醚。

图2 13个对照品溶液HPLC图谱与供试品的HPLC指纹图谱比较

1.hesperidin；2.glycyrrhizin；3.liquiritin；4.berberine；5.phellodendrine；6.atractyloadin；7.magnolol；8.curcumin；9.aloeemodin；10.emodin；11.rhein；12.chrysophanol；13.rheochrysidin.

Fig.2ComparisonofHPLCfingerprintofthesampleand13batchesofstandard

2.3.3稳定性实验 取同一样品(批号：S5)溶液在0，4，12，24 h分别按“2.2.3”项方法进样测定并分别记录其色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果21个共有峰相对保留时间的RSD均<0.40%，相对峰面积RSD均<1.32%(n=5)，结果表明供试品溶液常温下0～24 h可保持稳定。

2.4指纹图谱相似性评价

2.4.1共有指纹峰的标定 取10批如意金黄散供试品，分别按“2.2.2.2”项供试品溶液制备方法处理，在“2.2.1”项色谱条件下，测定其色谱图。利用中药指纹图谱相似度评价系统(2004A版)软件，以供试品S5的色谱图作为参照图谱，时间窗宽度为0.1，选取平均值方法，采用自动匹配法生成共有特征图谱R，并分析各批供试品之间共有峰和相似度，确定共有峰。结果显示10批供试品共有21个共有峰，见图4和图5，10批供试品图谱与共有特征图谱R相似度均>0.9，见表2。

2.4.2已知成分的确认 从13个对照品色谱图的各峰保留时间可知，7，8，9，10，12，14，15，18，19号峰保留时间与甘草酸、芦荟大黄素、大黄酸、姜黄素、大黄素、厚朴酚、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素对照品峰保留时间一致，可确认如意金黄散中含有这9种已知成分，见图4。

7.甘草酸；8.芦荟大黄素；9.大黄酸；10.姜黄素；12.大黄素；14.厚朴酚；15.大黄酚；18.大黄素甲醚；19.苍术素。

图4 如意金黄散共有特征图谱R

7.glycyrrhizin；8.atractyloadin；9.rhein；10.curcumin；12.emodin；14.magnolol；15.chrysophanol；18.rheochrysidin；19.atractyloadin.

Fig.4CommoncharacteristicsofHPLCchromatogramRofRuyihuangjinSan

图5 10批供试品HPLC指纹图谱相似度比较

Fig.5SimilaritycomparisonofHPLCfingerprintof10batchesofsamples

2.4.3参照峰的确定 7号峰为甘草酸，保留时间约31.6 min，在色谱图的中间位置，峰对称性好，峰面积值稳定，故选择甘草酸峰作为参照峰。标定各批号供试品的色谱图，设甘草酸峰的相对保留时间和峰面积为1，计算色谱图中各共有峰相对它的相对保留时间以及相对峰面积的值，并计算RSD值；10批供试品色谱图中，21个共有峰相对保留时间的RSD值≤0.22%，表明各共有峰的相对保留时间比较吻合，21个共有峰相对峰面积的RSD值在10.09%～48.00%之间，表明各共有峰相对峰面积波动大，说明不同来源药材成分含量相差较大，表明本实验建立的如意金黄散高效液相色谱指纹图谱可靠，具有全面性和代表性，见表3和表4。

3 讨论

在选择流动相时，参照《中华人民共和国药典》2015年版中测定甘草含量的高效液相色谱法洗脱程序和流动相做预实验，得到的色谱图信息量小，峰型差。预实验比较乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液不同流动相体系，发现以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，经梯度优化，各色谱峰能完全分离，峰型对称，故选择乙腈-0.1%磷酸溶液为本实验的流动相体系。

选择检测波长时，《中华人民共和国药典》2015年版中大黄蒽醌类检测波长254 nm，厚朴酚的最大吸收波长294 nm，橙皮苷最大吸收波长283 nm，苍术素最大吸收波长340 nm，实验中使用254，284，294，340 nm波长对样品进行检测，检测结果显示，254 nm波长处测得的色谱图中峰信息量最多且峰面积相对较大，9个对照成分的检测灵敏度最大，故采用254 nm作为检测波长，实验建立的色谱条件适应性好。

表2 10批供试品HPLC指纹图谱相似度

表3 HPLC指纹图谱共有峰相对保留时间

表4 HPLC指纹图谱共有峰面积

如意金黄散是由10味中药组成的复方制剂，包含大量水溶性成分和脂溶性成分，在供试品处理过程中，为兼顾两类成分提取和植物蛋白等杂质去除，以50%，70%，100%甲醇为溶剂，进行超声处理与加热回流；经过两种提取方法和提取时间的对比研究。结果表明，使用70%甲醇超声提取45 min得到的供试品溶液测得色谱图的峰信息量最多和峰面积最大；而对照品在甲醇中溶解度较大，所以对照品溶液用100%甲醇溶解配制。

10批供试品溶液的色谱图表明，实验选择的色谱条件适用，色谱图中主要的特征峰均可找到原药材归属，同时标示出13种已知成分的色谱峰，为这些已知成分的含量测定奠定了基础。本实验制得的指纹图谱，标示出了21个共有特征峰，特征峰的相对保留时间相对偏差小(RSD<0.22%)，说明色谱图稳定性好，特征成分稳定可靠检出；特征峰的相对峰面积相对偏差大(RSD>11.09%)，说明不同批次的供试品成分含量差异显著，不同产地和不同批号的原药材质量有较大的差异，为了保证如意金黄散质量的稳定性，必须保证原药材的质量和来源统一。本实验结果也表明，指纹图谱技术可以较全面地控制中药复方制剂的质量。