黄梅会，吴 华，王旭明

(海南省人民医院检验科，海南 海口 570311)

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)复合群和麻风分枝杆菌外的分枝杆菌，分为快速生长分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria，RGM)和缓慢生长分枝杆菌两大类，RGM是指7 d内在固体培养基上形成成熟菌落的一类分枝杆菌。RGM可存在于自来水、饮用水、医疗配水系统、淋浴喷头或其他物体表面，医疗设备或材料被其污染的水污染可导致医院感染[1]。随着各种先进医学诊疗手段的出现，各种侵入性手术、人工材料植入人体以及各种抗菌药物和免疫抑制剂使用频率的增加，该菌引起的感染越来越多。RGM感染的主要临床表现为肺炎、淋巴结炎、皮肤软组织感染及播散性疾病，由该类细菌引起的血流感染较为少见。不同菌种的RGM其药物敏感模式不同[2]，合理的经验性用药较不合适的经验性用药治愈率高(83.3% vs 42.98%)[3]。因此，快速、准确的菌种鉴定对RGM败血症的诊断及治疗有着重要的临床意义。本研究利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对2016—2017年海南省人民医院血培养分离的5株RGM菌株进行快速鉴定，并分析其临床特征。

1 资料与方法

1.1 病历资料

1.1.1 病例1 男性患者，69岁。患者2016年1月开始出现畏寒、发热，体温峰值39 ℃，发热无明显规律，在外院经治疗后体温可恢复正常，因仍反复发热于2016年4月11日入院。入院查体：体温37.8℃，双下肺呼吸音低，未闻及干湿性啰音。心腹无异常，双下肢中度水肿。既往于2012年行主动脉瓣置换术。辅助检查(2016年4月12日)：血常规白细胞4.80×109/L，C反应蛋白(CRP)54.54 mg/L，血沉70 mm/h。

1.1.2 病例2 男性患者，74岁。患者在住院期间(2017年6月8日—7月21日)因咽癌食管癌化学治疗(化疗)后第7天(2017年7月2日)出现发热，体温峰值40.3 ℃，伴腹胀、腹泻。查体：左颈部可触及肿大淋巴结，大小约2.5 cm×2.5 cm，质地硬，活动较差，心肺腹未见异常。辅助检查：2017年7月5日血常规白细胞17.71×109/L，中性粒细胞百分比82.8%，2017年7月11日CRP 191.37 mg/L。

1.1.3 病例3 男性患者，11个月23 d。入院前1周出现发热，体温峰值39.2 ℃，热型不规则，偶有咳嗽，呈非痉挛性咳，痰不易咳出。先后给予头孢克肟、头孢硫脒抗感染，因仍反复发热于2017年12月27日入院。查体：精神稍疲倦，双肺呼吸音粗，可闻及少许痰鸣音。辅助检查：2017年12月22日门诊血常规白细胞25.4×109/L，中性粒细胞百分比60.9%。入院当日血常规白细胞5.97×109/L，中性粒细胞百分比27.3%，血沉26.0 mm/h，2017年12月29日白介素6 221.0 pg/mL。

1.1.4 病例4 男性患者，3岁8个月。入院20天前出现发热，体温峰值39℃，伴有阵发性咳嗽、流涕。院外不规则给予美洛西林、阿奇霉素、哌拉西林/舒巴坦治疗，因门诊血培养分离出RGM于2017年12月12日入院。查体：双肺呼吸音粗，可闻及少许水泡音。辅助检查：外院血常规(2017年11月25日)白细胞13.59×109/L，中性粒细胞百分比65.3%，入院当日复查血常规白细胞6.42×109/L，中性粒细胞百分比61.1%，2017年12月13日血沉21 mm/h，2017年12月17日复查血培养阴性。

1.1.5 病例5 男性患者，93岁。患者因误吸引起吸入性肺炎于2015年4月3日入院，长期卧床、胃造瘘术后状态、中心静脉置管，基础疾病为脑梗死、血管性痴呆、冠心病。2016年2月13日开始出现间断低热，最高体温38.3℃，未予抗菌药物治疗。感染进行性加重，2016年2月29日出现高热，体温峰值40℃，呼吸急促。查体：呼吸23次/分，心率137次/分，BP 113/56 mmHg，SPO298%。双肺呼吸音粗，可闻及少许散在湿性啰音。2016年3月1日辅助检查：血常规白细胞49.6×109/L，中性粒细胞百分比81.3%，CRP 147.57 mg/L，痰及尿培养：铜绿假单胞菌。

1.3 RGM实验室鉴定

1.3.1 血培养 5株RGM分离自上述患者血标本，幼儿采集全血1～2 mL，成人8～10 mL直接注入血培养瓶，依照血培养仪操作手册置血培养仪中培养。

1.3.2 VITEK MS质谱鉴定 分枝杆菌预处理(梅里埃试剂盒)：用1 μL接种环取满环菌加入含有0.5 mm的玻璃珠和500 μL 70%乙醇的1.5 mL微量离心管，置振荡器涡旋震荡15 min，室温静置10 min灭活，涡旋震荡混匀并将全部液体转移至圆底无色空离心管中。12 000 g离心2 min，吸出所有上清丢弃(用加样器在沉淀物对侧尽可能吸出所有乙醇丢弃，如有极少量残余乙醇，可待其自然挥发，否则残余乙醇会干扰蛋白提取并稀释甲酸，影响检测效果)。加入10 μL甲酸，涡旋震荡充分混匀沉淀。加10 μL乙腈，涡旋震荡充分混匀沉淀。12 000 g离心2 min。立即取1 μL上清涂靶板，待完全干燥后加1 μL CHCA基质液形成结晶，待干燥后上机检测。

1.3.3 16s rRNA测序 复苏菌株送往华大基因有限公司进行16s rRNA测序鉴定。

2 结果

2.1 治疗及转归

2.1.1 病例1 患者入院后仍反复发热，体温峰值38.3℃。第5天出现咳嗽、咳白痰。第8天出现大小便失禁(1次)、头痛、反应迟钝、心率快(124 次/分)，血培养分离出RGM，考虑颅内高压、败血症，给予甘露醇、呋塞米脱水，异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、阿奇霉素抗感染。第10天出现头晕、乏力、胸闷、气促，骨髓培养分离出RGM，停用阿奇霉素，加用利奈唑胺。第13天突发心跳、呼吸骤停，病情急剧恶化，自动出院。共抗分枝杆菌治疗5 d。随访患者死亡。

2.1.2 病例2 经验性给予左氧氟沙星治疗2 d，效果欠佳，改为头孢哌酮/他唑巴坦治疗4 d。化疗后第10天，血培养分离出RGM，改为异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、亚胺培南抗感染8 d，好转出院。出院后继续口服抗分枝杆菌药满4个月，未再复发。

2.1.3 病例3 给予头孢哌酮/他唑巴坦治疗2 d，疗效欠佳，入院第6天血培养分离出RGM，改为阿奇霉素抗感染治疗5 d好转出院。出院后继续口服阿奇霉素满4周，未再复发。

2.1.4 病例4 2017年12月12日门诊血培养分离出RGM，入院后给予头孢哌酮/他唑巴坦联合阿奇霉素治疗10 d好转出院。出院后继续口服阿奇霉素4周左右，未再复发。

2.1.5 病例5 2016年2月28日开始给予头孢哌酮/舒巴坦联合利奈唑胺治疗。2016年2月29日患者病情急剧恶化，从气道吸出肠内营养物，血压及血氧饱和度进行性下降，尿量进行性减少，双肺可闻及大量哮鸣音，出现多器官功能衰竭，2016年3月2日，患者死亡。2016年3月1日送血培养，3月10日结果回报分离出RGM。

2.2 RGM鉴定

2.2.1 RGM生物学特征 5例患者血培养报警时间为2～5 d，血培养直接涂片革兰染色可见红色背景下菌体着色不均匀，形态不规则，部分菌体呈蓝色，部分菌体为粉红色，均可见链状排列的异染颗粒。阳性血培养转种血平板，培养24～48 h血平板可见针尖大小菌落，3～5 d可见圆形、凸起、湿润或干燥的菌落。菌落革兰染色后，菌体为革兰阳性，呈半透明，大小略长于MTB，细长直或微弯曲，有的呈梭形，粗细不一，有时有分支。菌体内含有1个至多个异染颗粒，1个颗粒多在菌体一端或中部，培养一周后再染色，可见位于顶端的颗粒膨大至菌体两倍，似火柴头样；多个异染颗粒可按串珠样排列至整个菌体。菌体抗酸染色大部分菌体呈蓝色，少部分菌体为粉红色或红色。

2.2.2 VITEK MS质谱鉴定 5株菌分别为马德里分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、产黏液分枝杆菌各1株，偶发分枝杆菌群2株。

2.2.3 16s rRNA鉴定 5株菌分别为马德里分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、产黏液分枝杆菌、偶发分枝杆菌、猪分枝杆菌各1株。

3 文献综述

应用PubMed、中国知网(CNKI)、万方数据库等检索工具检索近5年国内外诊断明确、资料较完整的RGM菌血症病例报道15例，其中国内3例、国外12例，另加该院5例确诊病例共20例。见表1。

表1 20例RGM菌血症病例资料汇总

N：文献未记载；ICD: 植入式心律转复除颤仪；PCR-RFLP：PCR-限制性片段长度多态性；16号患者失访2个月后因院外未佩戴除颤仪引起心脏骤停致死

4 讨论

RGM菌血症的临床症状缺乏特异性，诊断困难，且对常规一线抗结核药高度耐药导致治疗困难，开展快速而准确的菌种鉴定对患者的诊疗非常重要。RGM鉴定的方法主要有传统的细菌学技术、高效液相色谱法(HPLC)和分子生物学方法。传统细菌学技术耗时长、效率低，而高效液相色谱法虽然可以直接用于鉴定RGM，但是不能鉴别新的RGM菌种[19]。常用的分子生物学方法如16s rRNA操作要求相对较高，耗时长，而且需要特殊的仪器，无法在普通实验室普及。随着RGM在世界范围分离率的提高，急需寻找迅速、准确的鉴定方法进行日常鉴定。MALDI-TOF MS对RGM的检测简便、快速、通量高，操作相对不复杂，可用于普通实验室。本研究以16s rRNA为标准，利用MALDI-TOF MS技术对5株RGM菌株进行菌种鉴定，结果显示，MALDI-TOF MS技术对大部分菌株均能准确鉴定到种，对偶发分枝菌仅能鉴定到群，而无法准确鉴定到种。鉴于VITEK MS质谱的特殊性，可将已经准确鉴定的偶发分枝杆菌和猪分枝杆菌加入到数据库中，为今后更好的鉴定RGM提供数据资料。

大多数RGM血流感染为导管相关性，最常见于恶性肿瘤等免疫力低下人群，最多见的分枝杆菌为产黏液分枝杆菌和偶发分枝杆菌。表2汇总的20例病例中，5例检出产黏液分枝杆菌[9-12]，6例检出偶发分枝杆菌[13-17]，占总病例数的55%。20例病例中7例为导管相关感染[10-13, 15，18]，其致病菌分别为产黏液分枝杆菌(3例)、偶发分枝杆菌(3例，其中1例为偶发分枝杆菌群猪分枝杆菌种)、耻垢分枝杆菌(1例)；6例为恶性肿瘤化疗后(30%)[8, 11, 14-15, 17]。大多数产黏液分枝杆菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、头孢西丁、克拉霉素、亚胺培南、阿奇霉素敏感，最常用的抗菌药物为阿米卡星+克拉霉素[9-12]。偶发分枝杆菌大多对喹诺酮类及大环内酯类药物敏感，但其可能存在红霉素核糖体甲基化酶基因(erm基因)可诱导大环内酯类药物产生耐药[20]。《2012年非结核分枝杆菌诊断与治疗专家共识》[2](以下简称“共识”)推荐采用2种敏感抗菌药物，喹诺酮类、利福平或利福喷丁和克拉霉素或阿米卡星。该院产黏液分枝杆菌及偶发分枝杆菌病例均为幼儿患者，症状较轻，可能与这两种菌的毒力较低有关。“共识”提出新大环内酯类中克拉霉素和阿奇霉素是近20年来治疗NTM最重要的新药[2]，两例患者均使用阿奇霉素抗分枝杆菌治疗，治疗效果较好。

猪分枝杆菌引起的血流感染国内外均未见相关报道，但该菌为偶发分枝杆菌群的一员，可遵循偶发分枝杆菌治疗原则进行治疗。该院病例5为长期中心静脉置管的卧床患者，高龄，基础疾病多，免疫力低，在呼吸道及泌尿道感染的基础上并发猪分枝杆菌败血症导致患者在短期内病情急剧恶化，最终因严重的感染性休克并发多器官功能衰竭死亡。

脓肿分枝杆菌通常发生于注射受污染品、使用受污染的设备或材料进行侵入性操作、恶性肿瘤化疗等免疫力低下患者。本研究3例脓肿分枝杆菌感染患者中，1例疑为通过医疗设备感染[7]，2例为恶性肿瘤化疗后的免疫力低下患者[8]。该菌通常对克拉霉素、阿米卡星、头孢西丁、亚胺培南和利奈唑胺敏感，“共识”推荐将上述药物作为治疗该菌的关键药物[2]。虽然体外药敏试验显示，大多NTM对一线抗结核药高度耐药，该院脓肿分枝杆菌患者使用抗结核药联合亚胺培南治疗后病情明显好转，说明抗结核药在患者体内也可能会产生一定的作用。

“共识”缺乏RGM血流感染的专业指导，治疗主要以临床经验为主，尚未确定最佳治疗方案。RGM可附着于人工材料、导管等物体表面形成保护性生物膜而成为感染灶不易被常用抗菌药物去除，文献[1,9,13,15]报道未及时将感染灶移除患者较及时移除患者复发率高。因此，建议及时清除感染灶，避免治疗失败及感染复发。美国胸科学会和美国传染病学会推荐应给予两种以上敏感抗菌药物进行治疗[15]，Rodriguez-Coste等[3]证实使用至少两种抗菌药物治疗的患者，其转归较好。该院马德里分枝杆菌感染患者高龄，病史长(>3个月)，未能在较短时间进行敏感抗菌药物治疗并移除感染的人工心脏瓣膜，导致患者出现严重的感染性休克并发多器官功能衰竭而死亡。

近年来，RGM感染的病例逐年增加，特别是既往RGM败血症多为单个病例报道，而本研究在短短1年内即发生5例RGM败血症，而且其中2例患者死亡，需要引起实验室和临床医生的重视。本研究结合文献报道的15例RGM败血症病例，分析国内外RGM血流感染的现状，以协助微生物工作人员和临床医生进一步认识不同菌种RGM引起败血症的临床特征，帮助临床更好、更迅速的诊断和治疗，减轻患者的痛苦及经济负担，挽救患者生命。

致谢：感谢海南省人民医院儿科符彬莎医生对本论文的帮助！