王亚平，邢 爽，孙中贯，肖冬光

(教育部工业发酵微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

高级醇是指具有3 个碳链以上的一价醇类，包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇等[1].酒中含适量的高级醇，具有使酒口感协调、酒体丰满的作用；过量则带有苦涩怪味，给酒带来不良影响[2].并且，高级醇在人体内的代谢速度较慢，作用时间较长，当高级醇含量过高时就会造成饮后“上头”[3].白酒中的高级醇主要通过两个途径生成：一是酵母以氨基酸为基质的降解代谢路径，氨基酸经脱氨、脱羧生成比氨基酸少一个碳原子的高级醇[4]，在培养基中氨基酸过量时较易生成；二是酵母以糖为基质的合成代谢路径时，生成α-酮酸，经脱羧、还原生成高级醇[5]，在培养基中可利用氮源缺乏时较易生成.

在传统液态法白酒发酵过程中，由于采用纯种酒母和糖化酶为糖化发酵剂，酿酒原料、酿造工艺及微生物种类单一，微环境体系相对均一化，导致液态法白酒发酵体系中可利用氮源含量较低[6]，因而传统液态法白酒大多通过糖代谢途径生成高级醇，其高级醇生成量比固态法白酒高两倍左右[7]，且液态法白酒的风味物质丰富性不如固态法白酒，酒体相对单薄，缺乏固态法发酵白酒的自然感.固态法白酒存在的主要问题是需要手工操作、劳动强度大、生产效率低；而液态法白酒的高生产效率使之成为了科技工作者研究的目标.

针对液态法白酒的酒质问题，陈峻[8]提出了通过精选原料、蒸煮排杂、选择优良菌种发酵等技术措施.张昊等[9]在研究控制液态法白酒质量的技术中，认为除对原料品质的要求及控制蒸煮过程外，延长发酵时间可以增加发酵醪中的酸酯成分.关于液态法白酒中风味物质成分单一这一问题，行业内做了很多研究，通过固液勾兑等方法基本上解决了液态法白酒口味寡淡问题，但如何降低液态法白酒中高级醇的含量，仍然是行业内存在的主要问题.

为了实现白酒生产优质高效的目的，本文在传统液态法白酒的基础上，采用纯种酿酒酵母与酶制剂协同传统大曲糖化发酵的液态法大曲酒生产工艺，既保留固态法大曲酒多菌落发酵的特征，又弥补了大曲中酿酒酵母和某些酿酒酶系活性的不足[10].从酿酒原料、酵母菌种、接种量、酶制剂用量等角度，研究影响液态法大曲酒高级醇含量的主要因素，以及传统大曲与酵母、酶制剂协同发酵作用对高级醇的影响，优化液态法大曲白酒发酵工艺，为液态法大曲酒生产中高级醇含量的控制提供理论指导.

1 材料与方法

1.1 材料

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，均为工业生产用优良菌株，工业发酵微生物教育部重点实验室保存.

糯高粱、粳高粱、玉米，市售；清香大曲(含粗淀粉50.05%、糖化力792 mg/(g·h)、液化力0.93 g/(g·h)、水分14.23%)，北京红星股份有限公司；耐高温α-淀粉酶(2×104U/mL)、糖化酶(1×105U/mL)、酸性蛋白酶(5×104U/g)，诺维信(中国)生物技术有限公司.

UV-5200 型紫外-可见分光光度计、手持式糖度计、Agilent 7890B 型气相色谱仪、Agilent HPINNOWAX 型色谱柱(30 m×320µm×0.25µm)，美国安捷伦科技有限公司.

1.2 测定方法

采用直接干燥法按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准·食品中水分的测定》进行水分的测定.采用杜马斯燃烧法按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准·食品中蛋白质的测定》进行粗蛋白的测定.采用索氏抽提法按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准·食品中脂肪的测定》进行粗脂肪的测定.采用酸水解法按照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准·食品中淀粉的测定》进行总淀粉的测定.采用分光光度法按照GB/T 15683—2008《大米·直链淀粉含量的测定》进行直链淀粉的测定.采用分光光度法按照GB/T 15686—2008《高粱·单宁含量的测定》进行单宁的测定.酒度的测定参见文献[11]，采用酒精计法进行测定.采用血球计数板法测定酵母细胞数.挥发酸和总酯采用酸碱滴定指示剂法[12]进行测定.还原糖和残淀粉采用斐林试剂法[13]进行测定.高级醇采用气相色谱法[14]进行测定.淀粉出酒率按照参考文献[15]计算.

1.3 种子培养

一级种子：从试管斜面接种一环酵母菌于装有5 mL 玉米糖化醪培养基的20 mL 试管中，30 ℃静置培养24 h.

二级种子：将一级种子转接入装有100 mL 玉米糖化醪培养基的250 mL 三角瓶中，30 ℃静置培养16 h.

1.4 发酵工艺实验

原料粉碎，料液比为1∶3，加液化酶3 U/g 原料，在80～90 ℃下不断搅拌，液化1 h；待醪液冷却至60 ℃，加糖化酶60 U/g 原料并不断搅拌，糖化30 min；醪液冷却至40 ℃时，加酸性蛋白酶4 U/g 原料，并不断搅拌，作用15 min；醪液冷却至30 ℃时，根据各个实验的设置，接入二级种子酵母菌液和大曲；加水至发酵液总重为200 g，总体积约为170 mL，用250 mL 三角瓶进行发酵实验，于30 ℃培养箱静置发酵5 d，取样分析，每个实验重复3 次[16].

1.4.1 不同原料对液态发酵大曲酒的影响

分别制备粳高粱、糯高粱和玉米发酵培养基.加原料用量10%的清香大曲，接种酿酒酵母A-2 种子培养液6×106mL-1，30 ℃静置发酵5 d.

1.4.2 酵母菌种对液态发酵大曲酒的影响

以粳高粱为原料，比较酵母菌种A-1、A-2、A-3、A-4、A-5 的发酵效果.

选定酿酒酵母A-2 为菌种，分别进行不同接种量(2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106mL-1)的实验.

1.4.3 酶制剂对液态发酵大曲酒的影响

在1.4.2 选定的菌种和接种量的基础上，进行不同糖化酶用量(0、45、60、70、90、105 U/g)和不同酸性蛋白酶用量(0、2、4、6、8、10 U/g)的实验.

1.4.4 大曲用量对液态发酵大曲酒的影响

在以上实验选定的液化酶添加量3 U/g、糖化酶添加量60 U/g、酸性蛋白酶添加量4 U/g 的基础上，进行不同大曲用量(0、5%、10%、20%、30%、40%)的实验.

1.5 数据统计分析

所有实验均设置3 个平行样.采用Excel 2016统计分析软件对实验数据进行方差分析，数据表示为平均值±标准差，并使用t 检验对实验组与对照组之间差异进行显著性分析，*表示有显著差异(P＜0.05)，**表示有极显著差异(P＜0.01).

2 结果与分析

2.1 不同原料对液态发酵大曲酒的影响

不同原料的理化性质及对白酒液态发酵的影响见表1 和表2.糯高粱组为对照组，结果表明：就发酵酒度来看，糯高粱原料最低，粳高粱与玉米原料相差不大；从挥发酸含量来看，糯高粱原料最高，粳高粱原料次之，玉米原料最低；3 种原料发酵的总酯含量无明显差别；就高级醇含量来看，粳高粱原料、糯高粱与玉米原料相差不大；由于不同酿酒原料的品质差异，如单宁含量、支链淀粉与直链淀粉含量不同等因素造成白酒液态法发酵品质的差异.综合比较认为，粳高粱原料更适合液态法大曲酒生产.

表1 不同原料的理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of different raw materials

表2 不同原料对液态发酵大曲酒的影响Tab.2 Effect of different materials on liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2 酵母菌种对液态发酵大曲酒的影响

2.2.1 菌种

酵母菌种对液态发酵大曲酒理化指标的影响见表3，对主要高级醇含量的影响见图1.结果表明：5株酵母菌种发酵酒度无明显差别；挥发酸含量菌种A-1 最高，A-4 最低，其余3 株产酸相差不大；从总酯含量看，A-2、A-5 产酯能力较强，其余3 株相对较弱；从高级醇产量看，A-3 最高，A-2 最低.从图1 可以看出，与A-1 相比，A-2、A-3、A-4 的异戊醇含量有极显著差异.综上所述，在相同工艺条件下，来源不同的酿酒酵母由于其遗传多样性在酒度、挥发酸、总酯和总高级醇含量上有所不同.综合比较，酿酒酵母A-2 产高级醇总量最低、产酯能力较强、产挥发酸相对较少，比较适合用于液态法大曲酒生产用菌株，因此下面的实验以酿酒酵母A2 为菌种.

表3 酵母菌种对液态发酵大曲酒的影响Tab.3 Effect of yeast strain on liquid fermentation of Daqu Baijiu

图1 酵母菌种对液态发酵大曲酒中高级醇的影响Fig.1 Effect of yeast strain on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

2.2.2 酵母接种量

酵母接种量对液态发酵大曲酒酒度的影响见表4，对主要高级醇含量的影响见图2.

表4 酵母接种量对液态发酵大曲酒的影响Tab.4 Effect of yeast inoculation concentration on liquid fermentation of Daqu Baijiu

图2 酵母接种量对液态发酵大曲酒中高级醇的影响Fig.2 Effect of yeast inoculation concentration on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

从发酵结果看，随着酵母接种量从2×106mL-1增加至6×106mL-1，酒度明显增加；继续增大接种量，酒度增加不明显.酵母接种量为2×106mL-1时总高级醇含量最低，接种量在4×106mL-1以上时总高级醇含量几乎不再增加.从各高级醇的结果来看，异戊醇先升高后降低，其余3 种高级醇随着接种量的增加，含量逐渐增加.综合考虑酒度和高级醇含量酵母接种量以6×106mL-1为宜.

2.3 酶制剂用量对液态发酵大曲酒的影响

2.3.1 糖化酶用量

糖化酶用量对液态发酵大曲酒的影响见表5，对主要高级醇含量的影响如图3 所示.

表5 糖化酶用量对液态发酵大曲酒的影响Tab.5 Effect of the amount of glucoamylase on liquid fermentation of Daqu Baijiu

图3 糖化酶用量对液态发酵大曲酒中高级醇的影响Fig.3 Effect of glucoamylase on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

从酒度来看，当糖化酶的用量由0 U/g 增加到45 U/g 时，酒度从(10.37±0.10)%提高到(10.60±0.05)%；从高级醇含量的变化来看，随着糖化酶用量增加，正丙醇、异丁醇先降低后稳定，异戊醇逐渐增多，苯乙醇含量变化较小.总高级醇含量呈先下降后升高的趋势，当糖化酶添加量为60 U/g 时，高级醇总量最低，为(429.58±5.12)mg/L.这主要原因是适量的糖化酶用量，使淀粉的水解与糖的发酵达到动态平衡，而适量的糖浓度有利于酵母的酒精发酵，在此条件下高级醇的生成量减少.由此可见，通过调节糖化酶的用量，协调淀粉糖化与酵母酒精发酵的平衡，可适当降低液态法大曲酒中高级醇的含量.

2.3.2 酸性蛋白酶用量

酸性蛋白酶用量对发酵培养基中α-氨基氮含量的影响见表6，对液态发酵大曲酒的影响见表7，对主要高级醇含量的影响如图4 所示.

表6 酸性蛋白酶对发酵培养基中α-氨基氮含量的影响Tab.6 Effect of the amount of acid protease on the content of alpha amino nitrogen in fermentation medium

表7 酸性蛋白酶用量对液态发酵大曲酒的影响Tab.7 Effect of the amount of acid protease on liquid fermentation of Daqu Baijiu

图4 酸性蛋白酶用量对液态发酵大曲酒中高级醇的影响Fig.4 Effect of the amount of acid protease on higher alcohol in liquor fermentation of Daqu Baijiu

对照表5、表6 和图4，随着酸性蛋白酶用量的增加，培养基中α-氨基氮含量逐渐升高；从酒度看，酸性蛋白酶用量的影响不明显；从高级醇含量看，随着酸性蛋白酶用量的增加，高级醇总量和各主要高级醇含量都呈现先降低后升高的趋势，当酸性蛋白酶用量为4 U/g、培养基中氨基氮含量为(90.08±0.83)mg/L 时，总高级醇含量最低为(431.29±2.93)mg/L.这是因为当培养基中氨基酸充足时，酵母通过氨基酸降解代谢途径生成较多的高级醇；而在培养基中氨基酸缺少的情况下，酵母通过合成代谢途径，以糖为基质生成较多的高级醇；当培养基中氨基酸含量和酵母菌的需求量相适应时，高级醇的生成量最低.由此可见，通过调节白酒发酵体系中酸性蛋白酶的用量可适当调节成品白酒中高级醇的含量.

2.4 大曲用量对液态发酵大曲酒的影响

大曲用量对液态发酵大曲酒的影响见表8，对主要高级醇含量的影响如图5 所示.

表8 大曲用量对液态发酵大曲酒的影响Tab.8 Effect of the amount of Daqu on liquid fermentation of Daqu Baijiu

图5 大曲用量对液态发酵大曲酒中高级醇的影响Fig.5 Effect of the amount of Daqu on higher alcohol in liquid fermentation of Daqu Baijiu

从酒度和淀粉出酒率看，随着大曲用量的增加，先升高后逐渐降低.大曲的使用丰富了醪液中的酶系，如纤维素酶可将原料中的纤维素分解为可发酵性糖，适量的蛋白酶可增加发酵液中氨基酸的含量，有利于酵母菌的生长与酒精发酵；但随着大曲用量的继续增加，大曲中各种微生物群落的生长和代谢会消耗发酵液中的可发酵性糖，导致酒度和出酒率下降；当大曲用量达40%时，酒度下降达20%左右.从高级醇含量看，随着大曲用量的增加，高级醇含量明显下降；当大曲为 40%时，高级醇总量为(207.73±1.03)mg/L，与不加大曲的对照相比(519.07±11.47 mg/L)，高级醇含量降低了59.98%.大曲的使用增加了发酵醪液中的微生物种类，这些微生物与酵母对营养物质的竞争性利用，使酵母的生长代谢受到一定抑制，从而大大降低高级醇的生成量.可见通过调节大曲用量，协调传统大曲中的微生物与酿酒酵母的相互作用，可以有效地降低液态法大曲酒中高级醇的含量.

3 结 语

从酿酒原料、酵母菌、酿造用酶(糖化酶、酸性蛋白酶)和大曲用量等多个因素的发酵实验结果看，以粳高粱为原料、酿酒酵母A-2 为菌种，在酵母接种量6×106mL-1、糖化酶用量60 U/g、酸性蛋白酶用量4 U/g、大曲用量 40%的条件下，高级醇含量为(207.73±1.03)mg/L，相比初始发酵条件下的高级醇含量(434.62±4.06 mg/L)下降了52.18%，但同时淀粉出酒率下降了24.58%.由此说明采用传统大曲与纯种培养的酿酒酵母和商品酶制剂协同糖化发酵，可有效降低液态法白酒高级醇含量高的问题，这为液态法白酒品质的提高开辟了新的方法.但是，在白酒实际生产中，应综合考虑出酒率、高级醇含量、产品质量以及生产成本等因素，确定合理大曲用量，将高级醇含量控制在合适的范围.除大曲用量外，酵母菌种是影响液态法白酒高级醇含量的又一重要因素.本研究所用菌种均为生产上使用的工业菌株，若采用现代分子生物技术对酿酒酵母的高级醇代谢进行改造，即可实现在大曲用量较少的情况下生成适量的高级醇，达到优质高产的目的，这将是我们下一步研究的重点.