申须仁，董名扬，王朝勇，王 杰，周 强，3*

（1.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000；2.锰锌钒产业技术协同创新中心，湖南 吉首416000；3.锰锌矿业重金属污染综合防治技术湖南省工程实验室，湖南 吉首 416000）

锰（Mn）是植物代谢过程中必需的微量元素，当Mn含量超标时，植物会发生Mn毒反应，对植物的产量、生长发育、光合作用、矿质营养吸收等生理代谢活动均产生负面的影响[1-2]。Mn毒害也被认为是限制植物在酸性及渍水土壤生长的重要因素[3]。在我国南方地区的酸性土壤中、pH较低的水稻土壤中以及Mn矿区及尾渣库区的土壤中，Mn离子大量积累，对农作物生长及农产品环境安全造成巨大的危害[4]。尤其是在矿区，Mn元素可以通过各种途径进入农田土壤中[5]，灌溉农田土壤中Mn含量可达5700 mg·kg-1，其最大值可达10 000 mg·kg-1。矿渣堆周边的农田土壤Mn含量也接近1000 mg·kg-1，蔬菜中的Mn含量超过正常值5～80倍，亟待治理[6-7]。

近年来，重金属植物修复技术日益受到社会的重视和关注[8]。香根草[Vetiveria zizanioides（L.）Nash]是禾本科香根草属多年生C4类草本植物，根系发达、生物量大，每年干草产量可达100 t·hm-2。能够适应旱涝、酸碱等多种环境，并对多种重金属都有较强的耐受和积累能力，已广泛应用于环境修复领域[9-10]。其在农田生态系统中也有较广泛的应用。通过与作物间作，香根草可以防止农田水土流失、诱集作物害虫、修复多环芳烃污染土壤等[11-12]。所以，香根草在农业及废弃地的生态修复领域有着良好的应用前景。但目前对于采用植物修复技术治理高Mn污染的基础和应用研究较少，香根草对高Mn胁迫耐受和生理响应也未见报道。所以，本文采用实验室水培试验，研究高Mn胁迫对香根草矿质元素吸收和光合系统的影响，揭示香根草对高Mn胁迫的耐受范围、Mn积累特征及生理响应，以期为香根草用于高Mn污染地区环境修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用香根草由试验室长年种植在未受污染的苗圃中，在试验准备阶段，将分蘖繁殖得到的香根草幼苗单株培养，挑选长势健壮的香根草（苗龄5个月）置于1/2Hoagland营养液中培养，待其恢复生长后进行Mn胁迫处理。

1.2 试验设计

每3株香根草固定于1个500 mL塑料盆中，以1/2Hoagland营养液作为培养液，Mn以MnSO4·H2O的形式直接加入营养液中。以1/2Hoagland营养液作为对照处理，其他处理组的Mn浓度分别为：15、30、60、120 mmol·L-1，营养液pH调节至5.8，并隔日更换。于植物培养箱中生长60 d。培养条件为昼夜温度分别为（28±2）℃和（22±2）℃；白昼16 h·d-1；光照强度1000 μmol·m-2·s-1。每处理设置3个重复（即每处理3盆9株苗）。

1.3 含水率、株高、SPAD值、植株干物质质量的测定

将植物用去离子水多次冲洗，吸干表面水分称鲜质量。分离根、叶组织，在105℃下杀青20 min，70℃下烘48 h至恒质量，冷却至室温后称干质量（即整个植株干物质质量）。植物含水率=（鲜质量-干质量）/鲜质量×100%。植物株高用卷尺测量基部到叶片最高点的高度。采用SPAD-502叶绿素仪（Konica Minolta Sensing，日本）夹取植物倒3或倒4叶的1/4处和3/4处测量植物SPAD值。

1.4 Mn及矿质元素含量的测定

将香根草干样粉碎过60目筛。称取0.1 g并加入HNO3和HClO4（V∶V=4∶1）静置6～8 h，然后于石墨消解仪消煮至溶液澄清，冷却并定容于25 mL，再经滤纸过滤，于安捷伦240fs火焰原子吸收光谱仪（安捷伦，美国）测定矿质元素含量[13]；以24种金属元素混合标准液（GSB04-1767-2004）配制5个梯度浓度的标准液，制作标准曲线。每测定5～10个样品，将仪器重新置零，并测量一个浓度的标准品，以监测仪器的稳定性。

1.5 Mn富集系数与转移系数的测定[14]

Mn的根系富集系数=Croot/Csolution

Mn的转移系数=Cleaf/Croot×100%

富集量=Wroot×Croot+Wleaf×Croot

式中：Csolution表示培养液中的Mn含量；Croot表示根中的Mn含量；Cleaf表示叶中的Mn含量；Wroot表示根的干物质量；Wleaf表示叶的干物质量。

1.6 光合作用参数的测定

采用Li-6400便携式光合仪（LICOR，美国）于9：30—11：00进行测定，植物先在阳光下进行充分光诱导，然后进行光合测量。叶室光强根据环境光强设置为 1300 μmol·m-2·s-1，净光合速率（Pn）、气孔导度（Cond）、胞间二氧化碳浓度（Ci）、蒸腾速率（Trmmol）均从仪器直接读取。

图1不同浓度Mn对香根草SPAD值（A）、叶片含水率（B）、株高（C）和植株干物质质量（D）的影响Figure 1 Effects of different concentrations of manganese on SPAD（A），leaf water content（B），plant height（C）and plant dry weight（D）of vetiver grass

1.7 叶绿素荧光参数的测定

采用PAM-2500（Walz，德国）于20：00以后进行测定，植物先放置在黑暗环境下进行30 min暗适应。梯度作用光强为 8、16、32、90、165、245、325、430、580、770、1100、1400、1700 μmol·m-2·s-1，测定间隔为30 s。PSⅡ最大光化学效率（Fv/Fm）、潜在最大电子传导率（ETRmax）直接从仪器上读取，PSⅡ实际光化学效率[Y（Ⅱ）]、调节性主动耗散[Y（NPQ）]、非调节性被动能量耗散[Y（NO）]均通过系统自动拟合得出。

1.8 数据分析

以上试验数据使用SPSS 20.0进行Tukey算法以及多重比较分析，显著性水平为P＜0.05，数据均以平均值±标准误表示。并采用该软件中Pearson相关系数和双侧显著性检验进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 Mn对香根草SPAD、含水率、株高、植株干物质质量的影响

与对照相比，15、30 mmol·L-1Mn处理中，SPAD略微下降，但未达到显著差异水平；当Mn处理浓度在60 mmol·L-1和120 mmol·L-1时其出现显著性下降，且在120 mmol·L-1时，SPDA值最低，仅为对照的35.5%（图1A）。而香根草的含水率、株高、植株干物质质量在Mn处理浓度≥30 mmol·L-1时即出现明显的降低，株高、植株干物质质量下降已达到显著差异水平。随着Mn处理浓度的增加，3个参数下降的幅度更大。在120 mmol·L-1时，其分别为对照组的51.5%、70.3%和50.5%（图1B、图1C、图1D）。

2.2 Mn对香根草Mn含量、富集系数和转移系数的影响

Mn处理的根、叶中Mn含量均显著高于对照。在根部，30～120 mmol·L-1处理组间的Mn含量没有明显差异，且显著高于15 mmol·L-1Mn处理组（图2A）。而在叶中，15～60 mmol·L-1处理组间的Mn含量没有明显差异，但在120 mmol·L-1Mn处理时出现大幅度上升（图2B）。其转移系数的变化与叶片中的Mn含量变化一致。在15～60 mmol·L-1Mn处理下，转移系数为24.5%～28.1%，在120 mmol·L-1时，转移系数增加至66.5%（图2C）。香根草根系对Mn的富集系数随着Mn处理浓度的增加而显著降低，在120 mmol·L-1时降至2.9；Mn处理下根系的Mn富集系数始终大于1（图2D）。而富集量则在99.9～135.1 mg·株-1间波动。其中，120 mmol·L-1处理下的富集量要显著高于30、60 mmol·L-1处理（图2E）。

图2 不同浓度Mn对香根草根叶中锰含量、富集系数和转移系数的影响Figure 2 Effects of different concentrations of manganese on manganese content in roots and leaves，and transfer coefficients enrichment coefficients and bioaccumulation quantity

2.3 Mn对香根草K、Mg、Fe吸收的影响

Mn处理的根、叶中K含量呈现下降的趋势，当处理浓度≥30 mmol·L-1时，达到显著性差异，其中，根中K含量的下降幅度远大于叶中（图3A）。根中的Mg含量在Mn处理下显著下降，仅为对照的25.5%～39.4%，且Mn处理组之间的变化较小（图3B）。根的Fe含量则与Mg的变化相反，在Mn处理下呈现出不同程度的增幅，比对照组增加了1.9～3.9倍（图3C）。与对照相比，叶中Mg和Fe的含量在各处理组有上升和下降不同的变化，但变化幅度总体不大（图3B、图3C）。

图3 不同浓度Mn对香根草K、Mg、Fe吸收的影响Figure 3 Effect of different concentrations of manganese on the absorption of K，Mg and Fe in vetiver grass

2.4 Mn对香根草光合作用的影响

与对照组相比，Mn处理下Pn显著降低了37.3%～81.0%，并随着Mn浓度的增加而总体呈下降趋势。尤其在120 mmol·L-1处理组，其Pn值仅为对照的19.0%（图4A）。与Pn变化趋势相反，Ci在Mn处理下显著高于对照，且Mn处理组间的Ci较为相似（图4C）。Trmmol和Cond的变化趋势一致，在15 mmol·L-1处理组中，其与对照组无明显变化，在30、60 mmol·L-1处理下则出现一定程度的增加，但在120 mmol·L-1处理下则出现大幅度的下降，并显著低于对照水平（图4B、图4D）。

2.5 Mn对香根草叶绿素荧光参数的影响

Mn处理下香根草的Fv/Fm和ETRmax均呈现下降的趋势。ETRmax在15 mmol·L-1处理下即出现显著的下降，在60～120 mmol·L-1下降的幅度更大（图5B）。而Fv/Fm在15～30 mmol·L-1处理下保持稳定，当Mn浓度上升至60、120 mmol·L-1时，其显著低于对照组（图5A）。随着光强的增加，Y（Ⅱ）呈现下降的趋势，而Y（NPQ）呈现上升的趋势，Y（NO）基本保持稳定。Mn处理组的Y（Ⅱ）均低于对照，而Y（NO）均高于对照（图5C、图5E）；15、30 mmol·L-1Mn胁迫下，Y（NPQ）接近或低于对照；而30～120 mmol·L-1Mn胁迫下，Y（NPQ）总体高于对照（图5D）。

3 讨论

3.1 香根草对Mn胁迫的Mn耐受和积累能力及特点

过量的Mn会对植物产生一系列的生理毒害作用，多数植物对Mn的耐受浓度通常低于15 mmol·L-1。仅有水蓼[15]、木荷[16]等Mn超富集植物能够耐受高浓度的Mn胁迫。考虑到矿区土壤中可能存在高浓度的Mn离子，所以，本研究中设置的Mn处理浓度达到了120 mmol·L-1，与金政等[16]在木荷研究使用Mn浓度接近。PSⅡ的最大量子产量（Fv/Fm）是衡量原初光能捕获的最大能力的指标，植物处于逆境下，Fv/Fm下降，其直接反映植物受到外界胁迫程度[17]。植物叶绿素含量降低也是高Mn导致的胁迫伤害症状之一[18]。诸多研究表明在Mn胁迫下植物的Fv/Fm和叶绿素含量会明显下降[19-20]。本研究发现，香根草Fv/Fm（图5A）和SPAD（图1A）在15～60 mmol·L-1内接近正常水平，植株干物质量（图1D）也能维持在对照的77.6%～88.1%。说明香根草能够耐受60 mmol·L-1以下的Mn环境，具有良好的Mn耐受能力。在60 mmol·L-1以下的Mn处理中，根和叶中的Mn含量分别为14 393～18 845 mg·kg-1和4118～4782 mg·kg-1；并且，根中的Mn富集系数也大于1。总体而言，香根草有良好的Mn积累能力，远超于大多数植物（20～500 mg·kg-1）[19]。而且，在15～60 mmol·L-1的Mn环境下，根中的Mn含量已经达到Mn超积累植物的标准（Mn含量大于10 000 mg·kg-1）[19]，叶中的Mn含量达到该标准的40%。此外，试验中香根草Mn的富集量在15～60 mmol·L-1的Mn环境中差异不显著，可达99.9～115.2 mg·株-1。由于试验用苗是苗期，其生物量并不大（对照组生物量仅23.4 g·株-1），导致富集量偏小，有研究报道在4株·m-2密度下，经过8个月的生长，香根草的每株生物量可达300 g[21]，据此推测，香根草在高Mn环境中富集量相当可观，显示其具有用于高Mn污染环境修复的潜力。

图4 不同浓度Mn对香根草净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度、蒸腾速率的影响Figure 4 Effect of different concentrations of manganese on net photosynthetic rate（Pn），stomatal conductance（Cond），intercellular carbon dioxide concentration（Ci）and transpiration rate（Trmmol）of vetiver grass

在Mn处理下，香根草根部Mn的含量高于叶片，Mn转移系数为24.5%～28.1%（图2A、图2B、图2D），说明香根草的根部是富集Mn的主要器官，刘云国等[22]的研究也表明香根草根部是Cd离子的主要富集部位。随着Mn浓度的增加，根、叶中Mn含量表现出不一样的变化。在30～120 mmol·L-1Mn处理下根中的Mn含量保持稳定（图2A）。在15～60 mmol·L-1处理下叶中的Mn含量和转移系数无显著差异；但在120 mmol·L-1处理下，叶中Mn含量和转移系数均出现大幅度的增加（图2B、图2D）。结果表明在一定Mn浓度内，香根草根、叶中的Mn离子并没有随着Mn处理浓度的增加而递增。在木荷的根中也发现了类似的现象[16]。这可能是在高Mn环境中，香根草存在着限制Mn吸收和向叶片转运的机制。在超高Mn浓度下（120 mmol·L-1），可能由于该机制受到破坏，才导致Mn离子向地上部位运输增加，叶中Mn离子大量积累。

3.2 光合系统和矿质元素吸收对高Mn胁迫的响应

Mn过量会产生大量的活性氧，破坏叶绿素，影响PSⅠ与PSⅡ的活性，降低植物的光合速率[23]。水稻等农作物在Mn毒害下光合速率会显著降低，光合系统的有关基因表达会发生改变[24-25]，本研究发现，香根草光合作用受抑制程度与Mn处理浓度、根、叶中Mn含量呈极显著负相关（表1）。Pn显著下降，Ci显著增高（图4A、图4C），同时，ETRmax、Y（Ⅱ）也显著下降（图5B、图5C），这说明造成香根草光合速率下降的主要因素并不是气孔受限，而是光合系统和光合代谢活动受到了损伤。在Mn胁迫下，随着光照强度的增加，Y（NO）保持稳定，而Y（NPQ）显著增加（图5D、图5E），表明PSⅡ以热耗散等保护性调节机制消耗的光能增加。Y（NPQ）的增加是植物的一种保护机制[26]。梁文斌等[19]也认为是Mn超积累植物垂序商陆的保护机制之一。

图5 不同浓度Mn对香根草光系统Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）、潜在最大相对电子传递速率（ETRmax）、光系统量子效率[Y（Ⅱ）]、光系统Ⅱ调节性能量耗散[Y（NPQ）]、光系统Ⅱ非调节性能量耗散[Y（NO）]的影响Figure 5 Effects of different concentrations of manganese on maximum photochemical efficiency（Fv/Fm），potential maximum relative electron conductivity（ETRmax），quantum efficiency of photosystem Ⅱ [Y（Ⅱ）]，down-regulation energy dissipation[Y（NPQ）]，non-light induced energy dissipation[Y（NO）]of vetiver grass

植物体内矿质元素平衡是其正常生长发育的必要条件，重金属胁迫会改变植物体内矿质元素的吸收与分布[27]。本研究选取了大量元素K、中量元素Mg、微量元素Fe作为阳离子矿质元素的代表进行分析，结果显示，在高浓度Mn胁迫下，植物体内的3种元素在根、叶中表现出不同的变化趋势。在叶中，除K含量有一定程度的降低外（图3A），Mg和Fe的含量基本维持稳定（图3B、图3C）。但在根中，K和Mg的含量均出现大幅度下降（图3A、图3B），而Fe则显著增加（图3C）。相关性分析发现，根、叶中的K含量和根中的Mg含量与根、叶中Mn的含量呈极显著负相关（表1）。这可能是因为高Mn能抑制植物对K、Mg的吸收[28-29]。本试验发现根、叶中K含量与植株干物质质量和Fv/Fm呈极显著正相关（相关系数为0.675和0.674，0.772和0.750），暗示K营养在香根草耐受高Mn胁迫中具有重要的作用。此外，有研究发现Mn胁迫下Mn耐受型水稻根、叶中的Fe含量增加[28]。香根草根中Fe含量的增加可能是Mn耐受力强的表现。但有关机制还未见报道。

表1 处理溶液及根叶中Mn含量与香根草净光合速率、根叶中K、Mg含量的相关系数Table 1 Correlation coefficients between Mn contents in solutions，roots，leaves and net photosynthetic rate or K and Mg contents in roots，leaves of vetiver grass

4 结论

香根草能够长时间耐受60 mmol·L-1以下的Mn环境，并能够在根、叶中积累高含量的Mn，具有修复Mn污染环境的潜力。限制Mn离子的吸收和转运、增加PSⅡ调节性能量耗散消耗、维持叶中Mg、Fe的相对稳定是香根草对高Mn胁迫的适应性响应。