陶清华 陈小青 张 勇 庄永泽 王丽萍

研究发现代谢综合征(MS)可引起肾损害,而肾损害又可进一步加重MS[1]。越来越多证据支持内质网应激(ERS)与糖尿病肾病、肥胖相关性肾病、肾小球肾炎等多种肾脏疾病的发生发展密切相关[2-3]。通过减轻内质网应激治疗上述疾病已成为国内外广大学者研究的热点之一。我们前期临床研究发现，小檗碱可明显降低代谢综合征合并肾损害患者尿葡萄糖调节蛋白78(GRP78) mRNA、内质网应激相关蛋白(CHOP)mRNA表达，并降低其血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素8(IL-8)的含量，说明小檗碱可改善ERS，抑制机体微炎症反应及减少细胞凋亡而保护肾脏，但小檗碱是具体作用于内质网应激某一通路还是作用于三条通路而减轻ERS尚不得知。因此我们进一步细胞实验发现，小檗碱可抑制果糖诱导的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和真核启始因子(eIF2α)的磷酸化，使GRP78、CHOP表达减少，从而调节PERK-eIF2α-CHOP通路减轻细胞周期阻滞现象，减少细胞凋亡率保护肾脏[4]。在此基础上，我们进一步推测小檗碱也可能通过抑制内质网应激肌醇酶1(IRE1)-X盒结合蛋白1(XBP1)通路的过度激活，减轻内质网应激来保护肾脏。故本文采用小檗碱对代谢综合征合并肾损害患者尿IRE1、XBP1、半胱天冬酶12(caspase-12) mRNA及血、尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白表达情况的影响，从而探讨其保护肾损害的分子生物学机制，为小檗碱在临床的应用提供依据。

对象和方法

研究对象选自2016年2月至2017年1月勤保障部队第九○○医院肾内科门诊及住院临床诊断符合代谢综合征合并肾损害患者25例，采用随机表方式随机分成对照组、治疗组，失访5例，最后共纳入20例，对照组10例，其中男6例，女4例，年龄(32.60±12.27)岁；治疗组10例，其中男9例，女1例，年龄(38.30±9.96)岁。同时选取性别、年龄相匹配的健康者10例作为健康组。三组在年龄、性别上均无统计学差异，并且本研究已通过我院伦理委员会同意。

纳入标准(1)符合MS合并肾损害诊断标准；(2)年龄18～60周岁； (3)尿微量白蛋白/肌酐比值范围在30～200 mg/mmol；(4)血清肌酐(SCr)≤176.8 μmol/L； (5)肾损害病史出现在MS之后；(6)愿意在我院接受治疗和随访并签署知情同意书的患者。

排除标准(1)小檗碱过敏者；(2)12个月内使用糖皮质激素的患者；(3)8周内使用RAS阻断剂者；(4)糖尿病急性并发症；(5)Ⅰ型糖尿病、妊娠糖尿病；(6)肾病综合征；(7)除外急性肾功能不全者；(8)妊娠或哺乳期妇女；(9)合并严重感染、严重心、脑、肝和造血系统疾病及精神病患者。

诊断标准代谢综合征的诊断参照中华医学会糖尿病分会(CDS) 2013标准[5]。 慢性肾脏病的诊断参照改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)2012标准[6]。

退出标准(1)治疗期间出现过敏或发生不良事件，持续超过7d，无法继续试验：①谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)>正常值上限2倍；②SCr>176.8 μmol/L；③白细胞<3.0×109/L，或中性粒细胞<1.5×109/L。(2)研究者认为严重违背治疗方案(患者不能遵循研究流程及用药要求，依从性差未按规定用药或擅自应用降低小檗碱疗效的含鞣质的中药)。(3)出现过敏反应或严重不良事件者，根据医生判断应该停止临床试验者。(4)病程中病情恶化，根据医生判断应该中止临床试验者。(5)患者在临床试验过程中不愿意继续试验者。

治疗方法对照组：基础治疗，即针对患者原有疾病的治疗，如糖尿病、高脂血症、高血压、蛋白尿的治疗。治疗组：基础治疗+小檗碱，小檗碱剂量为0.3克，口服3次/d。两组观察时间均为8周。

实验方法

标本的采集及处理

尿液标本的采集嘱患者随访前一天20:00后禁食禁水，访视当天留取清洁中段晨尿15 ml，低温离心后弃上清，取沉渣提取RNA。

血清标本采集采集患者随访当天的空腹静脉血液标本5 ml，低速离心分离出血清(常温，3 000 r/min，5 min)，放入-80℃冰箱保存。

标本检测方法

尿液IRE1、XBP1、caspase-12mRNA测定采用RT-PCR法进行操作：Trizol提取尿RNA，反转录酶逆转录RNA为cDNA，在PCR仪上进行扩增。IRE1引物序列为：上游5′-TCTGCCCATCAACCTCTCTT-3′，下游5′-CTGTCCACAGTCACCACCAG-3′，产物长度193 bp；XBP1引物序列为：上游5′-GGAGTTAAGACAGCGCTTGG-3′，下游5′-TCAATACCGCCAGAATCCAT-3′，产物长度191 bp；caspase-12引物序列为：上游5′-CTCAACATCCGCAACAAAGA-3′，下游5′-CACCAGGAATGTGCTGTCTG-3′，产物长度204 bp；GAPDH引物序列为:上游 5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′，产物长度200 bp。PCR产物在1.0%琼脂糖上进行凝胶电泳。应用凝胶成像系统摄取所需各样品电泳图。通过Image J图像分析软件将各样品电泳图转换为灰度值，基因的表达量由平均灰度值代替。平均灰度值=目的基因吸光度值(A)/β-actin吸光度值。

血清和尿液中IRE1、XBP1、caspase-12蛋白测定采用ELISA法进行操作，所有操作均按试剂盒内所附说明书进行，最后用ELISA Calc回归/拟合计算程序由说明书中标准物的浓度与所测得的吸光度OD值计算出标准曲线的方程式，由方程式计算出样品的浓度。

观察指标收集患者一般资料包括性别、年龄、体重、身高、腰围、血压、体质量指数(BMI)。

收集患者治疗前(T0)、治疗后4周(T1)、治疗后8周(T2)血、尿指标 空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPBG)、空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿微量白蛋白/肌酐比值(U-mAlb/UCr)。

采用RT-PCR法检测尿液中IRE1、XBP1、caspase-12mRNA的表达；采用ELISA法检测血清及尿液中IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表达。

不良反应 记录患者治疗前后的血常规、肝肾功能(总蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、谷氨酰转肽酶、胆红素)、肾功能(尿素氮、SCr、尿酸)，及用药期间是否出现消化道症状、皮疹等。

统计学方法采用《SPSS 20.0》软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，计量资料组内比较采用配对t检验，组间比较采用组间方差分析，符合正态分布采用t检验，非正态分布采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

基线资料两组患者基线时腰围、BMI、血压、血脂、SCr、BUN、eGFR、U-mAlb/UCr及基础治疗情况均无统计学差异(表1)。

表1 对照组与治疗组基线资料

BMI：体质量指数；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；SCr:血清肌酐；BUN：尿素氮；eGFR:估算的肾小球滤过率；U-mAlb/UCr:尿微量白蛋白/肌酐比值；ACEI：血管紧张素转换酶抑制剂；ARB：血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂;α-GI:α葡萄糖苷酶抑制剂

临床观察指标的比较与治疗前比较，治疗组治疗8周后BMI、收缩压、舒张压、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C、U-mALb/UCr均明显下降(P<0.05)，对照组治疗8周后SBP、DBP、U-mALb/UCr明显下降(P<0.05)，两组在BMI、FBG、2hPBG、FINS、TG、LDL-C比较上具有统计学差异(P<0.05)。两组治疗前后在腰围、HDL-C比较上均无统计学差异(表2)。

表2 两组治疗前后临床观察指标的比较

BMI:体质量指数；FBG：空腹血糖；2hPBG:餐后2h血糖；FINS：空腹胰岛素；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇；U-mALb/UCr：尿微量白蛋白/肌酐比值；#:与治疗前相比，P<0.05;△:与对照组同时间点相比，P<0.05；T0:第0周;T2:第8周

实验室指标的变化

血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白 与健康组比较，治疗前两组血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表达均升高(P<0.05)，但两组间无差异。治疗8周后，两组血清XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表达均较治疗前下降，对照组下降不明显(P>0.05)，治疗组下降明显(P<0.05)，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)(表3)。

表3 各组患者治疗前后实验室指标变化

XBP1：X盒结合蛋白1；IRE1：肌醇酶1；caspase-12：半胱天冬酶12；T0:治疗前，T2:治疗后8周；*：与健康组比较，P<0.05；#：与治疗前比较，P<0.05；△：与对照组同时间点比较，P<0.05

尿液XBP1、IRE1、caspase-12蛋白 与健康组比较，治疗前两组尿XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表达均升高(P<0.05)，两组间无统计学差异。治疗8周后，两组尿XBP1、IRE1、caspase-12蛋白表达均较治疗前下降，对照组下降不明显(P>0.05)，治疗组下降明显(P<0.05)，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)(表3)。

尿液XBP1、IRE1、caspase-12 mRNA 随着治疗时间的延长，治疗组尿液XBP1、IRE1、caspase-12 mRNA的表达量逐渐减少，对照组其表达量无明显改变(图1)。

图1 尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA电泳图

与健康组比较，治疗前两组尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA灰度值均明显升高(P<0.05)，两组间无明显差异。治疗8周后，两组尿液XBP1、IRE1、caspase-12mRNA灰度值较治疗前下降，治疗组下降明显(P<0.05)，对照组下降不明显(P>0.05)，治疗组疗效优于对照组(P<0.05)(表3)。

讨 论

内质网是细胞内重要的细胞器，具有调节细胞正常稳态的生理功能。当细胞遇到营养缺乏、缺氧、代谢失衡、病毒感染、氧化应激等因素时，内质网加工、修饰、运输蛋白质的功能发生紊乱，即形成ERS。大量研究表明，ERS反应主要通过IRE1-XBP1、PERK-eIF2α、ATF6三条信号介导通路，其中IRE1信号介导通路在ERS反应中发挥着核心作用。XBPl是ERS反应的关键信号调控因子，XBP1mRNA及蛋白表达的上调是IRE1活化所导致的特异性反应，可提示肾脏损伤后存在IRE1介导通路的活化[7]。caspase-12介导的细胞凋亡途径是ERS反应诱导的三条细胞凋亡通路中重要的一条，ERS应激时caspase-12表达上调，而且作为细胞凋亡的起始因子，在ERS反应中也具有非常重要意义[8-10]。

研究发现小檗碱除具有降糖、降压、降尿酸、降脂、改善胰岛素抵抗，减轻体重等作用[11]，还具有肾脏保护作用。Wan等[12]研究发现，小檗碱可改善肾脏的高胆固醇血症和氧化还原状态，抑制iNOS及TGF-β在肾脏表达水平，并减弱核因子κB(NF-κB) DNA活性、下调p65/p50和IKKβ蛋白水平，最终改善动脉粥样硬化大鼠慢性肾损伤。亦有研究证明，小檗碱可通过调节ERS信号传导通路保护肾小管近端上皮细胞损伤、降低足细胞凋亡，从而保护肾脏[13-14]。本研究发现，小檗碱治疗8周后，治疗组BMI、FBG、2hPBG，TG、LDL-C、FINS水平均低于对照组(P<0.05)，治疗组尿IRE1、XBP1、caspase-12mRNA，血及尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表达均低于对照组(P<0.05)，说明小檗碱可改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢紊乱，且抑制内质网应激IRE1-XBP1通路的过度激活，缓解内质网应激反应，但其作用机制尚不清楚。有研究发现，IRE1-XBP1信号通路能维持肠道黏膜屏障、维持肠道潘氏细胞数目、促进肠道内细胞因子分泌等方式保护肠道黏膜，减少肠道炎症的发生[15]。还有研究发现，小檗碱具有调节肠道菌群，抑制有害菌生长，保护肠道潘氏细胞，减轻炎症反应，改善内毒素血症的作用[16]。由此我们推断小檗碱可能通过上述作用改善肠道菌群而减轻内质网应激IRE1-XBP1通路的过度激活，但其具体作用机制还需进一步的研究。

综上所述，小檗碱可降低代谢综合征合并肾损害患者尿IRE1、XBP1、caspase-12 mRNA，血及尿IRE1、XBP1、caspase-12蛋白的表达，并可改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢紊乱水平，其机制可能与小檗碱可抑制代谢综合征合并肾损害患者内质网应激IRE1-XBP1通路的过度激活有关。本研究尚有如下不足之处：(1)本研究是单中心小样本临床研究，病例数较少，且入组标准为代谢综合征合并肾损伤患者，病例有较大的异质性，仅能作为观察性研究结果，机制的分析还需要进一步研究。(2)随访时间仅8周，未进一步随访患者IRE1、XBP1、caspase-12水平的变化。(3)血清标本留取较少，为避免反复冻融，未检测患者的血清IRE1、XBP1、caspase-12 mRNA的表达。因此，尚需更大样本、更长时间的多中心研究，并通过动物实验相互验证，从而得出更加科学的研究结论。