杨海淦 曹 蕊 王茂杰 陈育忠

1.广州中医药大学第一附属医院胃肠外科，广东广州 510000；2.广州中医药大学第一附属医院重症医学科，广东广州 510000；3.广东省中医院风湿科，广东广州 510000

神经胶质细胞简称胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的重要组成部分，约占90%[1]。自Pfrieger 等[2]1997 年首次报道胶质细胞能促进神经元间的突触联系后，胶质细胞的作用越来越引起神经科学研究者的重视。

一氧化氮（NO）是一种非经典神经递质、细胞功能调节因子，在中枢神经系统中广泛分布，参与胶质细胞各种生理及病理状态的调控，是细胞间信息交换的重要介质。NO 根据所处氧化状态的不同，可发挥神经保护或神经毒性作用[3-7]。NO 在低浓度时对细胞有保护作用，而在高浓度时则可产生细胞毒性作用[8]。

历代本草中，普遍认为石菖蒲性味辛、苦、温，入心、胃经，能豁痰开窍、化湿和胃、醒神益智，是芳香宁神、涤痰开窍之要药。临床上常用于热病神昏、癫狂、痰厥、健忘、阿尔茨海默病等疾病的治疗。研究[9]发现，石菖蒲具有良好的脑细胞保护作用，能增加小鼠脑组织超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低脑内过氧化脂质（LPO）水平。然而，相关研究仅仅局限于石菖蒲有效成分的药理作用上，并未从免疫生化以及分子遗传等方面进行探讨。为了进一步从分子生化方面探讨石菖蒲作用的相关机制，笔者设计了本实验，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

人脑神经胶质细胞（HEB，中山大学细胞动物实验中心）；细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（Gibco 公司）；0.25% 供应胰酶（Trypsin-EDTA）（1×）（GIBCO）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）PH 7.2 basic（1×）（GENOM）；石菖蒲饮片（康华药业）；四甲基偶氮唑盐比色试剂（MTT）（广州妙博生物技术有限公司）；NO（碧云天生物技术）；倒置显微镜（NIKON TE300）；二氧化碳培养箱（HSO301T-VBA）；真空冷冻干燥机（Christ Alpha2-4LSC-Plus）、旋转蒸发仪（RV 10basic V）。

1.2 石菖蒲冻干粉的制作

将100 g 石菖蒲饮片高速粉碎后转移到圆底烧瓶中，加1000 mL 的超纯水，于电热套上加热，猛火烧沸后调至温火继续煮1 h，收集第一遍的水提液；再加400 mL 超纯水至药渣中继续第二次煎煮，时间火候同第1 次，后将2 次收集的水提液混合；将收集的水提液离心2 次（3000 r/min，5 min），收集上清液，转移到圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上进行浓缩，最终浓缩液量约为100 mL，即药物浓度为1 g/mL。

将浓缩液分装于培养皿中，用保鲜膜封好，置于-80℃冰箱过夜。隔日放于冷冻干燥机冷冻干燥24 h。干燥后将冻干粉转移到离心管中，称量后分装保存。使用前先用细胞培养基（含10%胎牛血清）配成浓度为1 mg/mL 的母液。

1.3 细胞培养

将HEB 置于37℃5% CO2的二氧化碳培养箱培养。细胞传代时将旧的细胞培养液去掉，加2 mL PBS洗2 次，去掉PBS，再加1 mL 胰酶进行消化，时间大约1 min，迅速去掉胰酶，加入3 mL 完全培养基终止消化，后进行吹打，使细胞剥落，充分吹匀后平均分到2 个75 mm2的培养瓶中，再向培养瓶中加入5 mL完成培养基，拧好盖子后放回培养箱中培养。

1.4 MTT 检测细胞活性

细胞以每孔3000 个细胞种于96 孔板种，待细胞贴壁后弃去培养液，分成对照组（磷酸盐缓冲液0 μg/L）、石菖蒲水提取物组，分别加入37.5、75、150、300、600、1000 μg/L 的石菖蒲水提取物。放回培养箱继续培养不同时间（24、36、48 h）。每隔12 h 取1 个96 孔板进行实验，避光，每孔加20 μL MTT 试剂（5 mg/mL），放回培养箱中孵育4 h。孵育完成后用一次性无菌注射器（1 mL）贴壁慢慢吸走含MTT 的培养液，再每孔加入150 mL 的DMSO，于多微孔板震荡器上震荡10 min。在酶标仪上使用570 nm 波长检测OD 值，保存数据。

1.5 检测NO 的表达

以每孔10 万个细胞数种24 孔板，待细胞贴壁后弃去培养液，加用不同浓度的LPS（0、10、100、1000、10 000、20 000 ng/mL）放回培养箱继续培养24 h，取上清液进行实验。确定LPS 浓液后，进一步将实验分成对照组（磷酸盐缓冲液组）、石菖蒲37.5 μg/mL 组、石菖蒲75 μg/mL 组、石菖蒲150 μg/mL 组、石菖蒲300 μg/mL组、石菖蒲600 μg/mL 组。培养2 h 后加用LPS（1 μg/mL），放回培养箱继续培养22 h，取上清液进行实验。取出NO 试剂盒的Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ，使回复室温。用DMEM+10%FBS 稀释标准品（1～100 μmol/L），使其梯度为0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔，在96 孔板中加入标准品及培养液上清。按50 μL/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent Ⅰ以及Griess Reagent Ⅱ，最后在酶标仪上使用540 nm 波长检测OD 值，保存记录数据。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石菖蒲水提取物药物浓度选择

MTT 结果提示石菖蒲水提取物对HEB 细胞活性具有显著抑制作用（P ＜0.05），且呈浓度和时间依赖性。而1000 μg/mL 浓度的石菖蒲水提取物出现明显抑制细胞活性，考虑与药物浓度过大出现细胞毒性作用。见表1。故后续实验仅选0～600 μg/mL 的浓度范围。

2.2 不同浓度LPS 对HEB 诱导的NO 表达的影响

在加用LPS 后可发现当浓度≥100 ng/mL 时即可明显诱发HEB 产生大量NO，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），而且随着药物浓度的不断升高，其效应更加明显，提示LPS（100 ng/mL）可成功诱导HEB 的病理模型。见表2。

表1 不同浓度石菖蒲水提取物不同作用时间对细胞活性平均抑制率的比较（±s，n=3）

表1 不同浓度石菖蒲水提取物不同作用时间对细胞活性平均抑制率的比较（±s，n=3）

注：与对照组（0 μg/mL）比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，#P ＜0.001

表2 不同浓度LPS 对HEB 诱导NO 表达的影响

2.3 不同浓度石菖蒲水提取物对LPS 诱导的HEB NO 的表达的影响

在LPS 诱导的HEB 病理模型上，加用石菖蒲水提取物后可明显抑制NO 的表达。在低浓度37.5 μg/mL即可明显抑制由LPS 1 μg/mL 所诱导的NO 高表达。随着药物浓度升高，其抑制作用明显增强，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表3。

表3 不同浓度石菖蒲水提取物对LPS 诱导的HEB NO 表达的影响（n=3）

3 讨论

既往对石菖蒲的药理研究主要集中在挥发油、水煎液、水提醇沉液对中枢神经系统的作用上，普遍认为石菖蒲挥发油具有中枢镇静、催眠、抗惊厥作用[10-14]。如早在1982 年，金维岳[15]经过相关临床研究后提出，用单味石菖蒲挥发油制成的注射液（0.5%总挥发油溶液）治疗肺性脑病昏迷，能迅速消除意识障碍和神经精神症状，有效率高达74.97%。此外，石菖蒲能促进正常小鼠学习记忆和记忆获得[16]。21 世纪，方永奇等[17]研究石菖蒲醒脑开窍作用的物质基础及其作用机制研究，提出石菖蒲醒脑开窍和保护神经细胞的有效部位主要是挥发油和β-细辛醚。故无论是中国历史文献资料还或现代临床及机制研究结果都表明石菖蒲对大脑的正常功能发挥起到促进作用。然而，本研究发现石菖蒲水提取物对神经胶质细胞的活性并无明显作用，考虑可能与其正性作用仅仅体现在对中枢神经系统即神经元的影响上，而对周围神经系统如神经胶质细胞等的功能并无明显的促进作用。

NO 是由L-精氨酸（LArg）和分子氧为底物，在一氧化氮合成酶（NOS）的催化和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黄素单核苷酸（FMN）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四氢生物喋呤（BH4）等因子辅助下，使L-精氨酸的胍基氮原子被氧化而成的[18]。神经胶质细胞中的NOS 为诱导型一氧化氮合酶，在细胞因子、内毒素以及某些内源性异常蛋白的作用下，星形胶质细胞、小胶质细胞可产生大量的NO，为病理型[19-20]。本研究发现石菖蒲可明显抑制LPS 诱导的HFB 中NO 的浓度，推测很有可能石菖蒲提取物是通过直接抑制诱导型NOS 的活性或影响神经胶质细胞内L-精氨酸或分子氧两种底物的浓度，或iNOS催化过程中所需要的各种辅助因子的合成过程有关。故而进一步阐明石菖蒲提取物对病理型NO 的生成过程各种因子及催化酶的影响将成为我们今后努力的方向之一。另外，本研究还发现石菖蒲提取物对未诱导的正常HEB 并没有抑制作用，而且MTT 结果也提示其对细胞活性无明显影响，这可能与HEB 在被诱导活化后某基因的异常表达有关。