李江

摘要：目的  对比细菌培养与聚合酶链反应（PCR）检测在细菌性痢疾检测中的应用效果。方法  选取2018年1月～2019年1月在我院诊治的220例腹泻患者作为研究对象，分别采用细菌培养与聚合酶链反应（PCR）对其粪便标本进行检测，对比两种方法检出率及患者基本情况对检出率的影响。结果  PCR检出率50.45%高于细菌培养4.54%，且不同年龄患者PCR的检出率均高于细菌培养法，差异有统计学意义（P<0.05）;在PCR检测中，培养阴性、非脓血便、年龄≥5岁与培养阳性、脓血便、年龄<5岁病例PCR平均循环数对比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  在细菌性痢疾的检测中PCR检测与细菌培养对比具有更准确的评估作用，利于临床对细菌性痢疾人群的评估，具有临床应用的重要意义。同时不同年龄患者PCR检出率存在差异，且脓血便可作为判断志贺菌感染程度的指标之一。

关键词：细菌培养;聚合酶链反应;细菌性痢疾

Abstract：Objective  To compare the effects of bacterial culture and polymerase chain reaction （PCR） detection in the detection of bacterial dysentery.Methods  A total of 220 patients with diarrhea diagnosed in our hospital from January 2018 to January 2019 were enrolled in this study. Bacterial culture and polymerase chain reaction （PCR） were used to detect fecal specimens. Compare the detection rate of two methods and the impact of basic situation of patients on the detection rate.Results  The PCR detection rate was 50.45% higher than that of bacterial culture 4.54%， and the detection rate of PCR was higher than that of bacterial culture method，the difference was statistically significant （P<0.05）. In PCR detection， culture was negative and non-culture. There was a statistically significant difference in the average number of PCR cycles between pus and bloody stools， age≥5 years and culture-positive， pus and bloody stools， there was a statistically significant difference in the mean number of PCR cycles between the ages <5 years old （P<0.05）.Conclusion  PCR detection and bacterial culture in the detection of bacterial dysentery have a more accurate evaluation， which is conducive to clinical evaluation of bacterial dysentery， and has important clinical significance. At the same time， the PCR detection rates of patients of different ages are different， and pus and blood can be used as one of the indicators to judge the degree of Shigella infection.

Key words：Bacterial culture;Polymerase chain reaction;Bacterial dysentery

細菌性痢疾（bacterial dysentery）属于临床常见的多发病，是由志贺菌属细菌引起的肠道传染。患者主要伴有发热、腹泻、腹痛、黏液性脓血样便症状，严重影响患者的身体健康[1]。随着现代医疗水平的不断提高，卫生条件显著改善，细菌性痢疾发病率有所下降。但是志贺菌感染仍然是我国现下重要的公共卫生问题之一[2]。临床常用的检测方法有细菌培养、PCR检测。但有研究显示，细菌检测确诊细菌性痢疾诊断率不高，容易出现漏诊。因此，本研究选取2018年1月～2019年1月在我院诊治的220例腹泻患者作为研究对象，对比细菌培养与PCR检测在细菌性痢疾检测中的应用效果，为临床提供一定的参考依据，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料  选取2018年1月～2019年1月在湖北省荆州市第三人民医院诊治的220例腹泻患者进行研究。纳入标准：①符合细菌性痢疾诊断标准;②粪便镜见均可见白胞每高倍视野15个以上，可见少量红细胞。③年龄0～53岁。排除标准：合并有心、肝、肾等严重系统疾病者。男性124例，女性96例;年龄0～53岁，平均年龄（35.17±2.11）岁。

1.2方法

1.2.1仪器、试剂  美国ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪，JIDI-4D-WS自动平衡实验室离心机。培养基包括：SS培养基;麦康凯培养基;亚硝酸盐增菌培养基;GN增菌培养基分离/增菌培养;双糖铁培养基;三糖铁培养基。

1.2.2细菌培养  培养基内接种粪便标本，温度控制在37℃，培养24 h 后将可疑菌落挑出，并进行生化鉴定，血清型由血清凝集反应判断。阳性标准：有典型菌落出现，经生化鉴定，提示志贺菌感染。

1.2.3 PCR技术检测  引物选择：扩增志贺ipaH基因片段引物碱基序列。从培养14 h的SS琼脂平板菌落中提取DNA，接种单菌落于LB或脑心平板，不间断的连续画线，在37℃培养18～24 h。再取150 μl蒸馏水，与其充分混合数接种环菌苔，在100℃水煮10 min，离心后取上清液，并于零下20℃存放待检测。使用PBS缓冲液洗涤、沉淀后再次离心，提取菌体后置于TE缓冲液、10%SDS及蛋白酶K内消化60 min，用量分别取467 μl、30 μl、3 μl。DNA抽提采用取酚-氯仿法。dNTP 混合物、氯化镁及相应引物终浓度各取200 μmol/L、2 mmol/L 与100 pmol/L，10×PBS 缓冲液、Q-solution、Taq-DNA 聚合酶及模板DNA 各取5 μl、5 μl、1.25 U 及2 μl。在94℃温度下预变性、变性各7 min 和1 min，退火与延伸温度各为60℃和72℃，时间各为2 min 和4 min，PCR 循环数共40 个。能检测到产物的循环数≤38则为阳性。含有化学试剂10%福尔马林、苏木素、伊红、EDTA、苯酚、氯仿、2%SDS对PCR存在抑制的阴性标本[3]。

1.3观察指标  对比PCR和细菌培养两种方法细菌性痢疾检出率、PCR检出结果年龄分布特點。

1.4统计学方法  数据分析使用SPSS 24.0统计软件包，计量资料采用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，计数资料采用[n（%）]表示，两组间比较采用？字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同年龄患者细菌性痢疾检出率比较  PCR检出率高于细菌培养，差异有统计学意义（P<0.05），且不同年龄患者PCR的检出率均高于细菌培养法，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2检测结果的分布特点  在PCR检测中，培养阴性、非脓血便、年龄>5岁与培养阳性、脓血便、年龄<5岁病例PCR平均循环数对比，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

随着细菌流行病学的研究不断进展，关于PCR的实践研究已有大量报道[4]。PCR检测细菌性痢疾，具有快速、高特异性、高敏感性等特点，并且该方法对样本数少或某些难鉴别血清学标记鉴别的腹泻菌种也适用。传统的细菌培养方法耗时长，且操作复杂，阳性检测结果低，容易漏诊。相关研究显示标本检测结果中[5]，志贺菌属ipaH在PCR检测结果阳性，但是不一定发病，而ipaH及ial双基因同时检测阳性标本为细菌性痢疾患者。因此，比较PCR于细菌培养在检测志贺菌上的区别具有重要的临床意义。PCR检测原理决定PCR循环数可影响反应的特异性和产率。从而PCR循环数也可以作为评价PCR检测特异性和准确性的一个指标。

本研究结果显示，PCR检出率为33.63%，高于细菌培养4.54%，且不同年龄患者PCR的检出率均高于细菌培养法，差异有统计学意义（P<0.05）;由此可见PCR检测志贺菌率高于细菌培养，与已有的研究结果基本一致。在PCR检测中，培养阴性、非脓血便、年龄≥5岁与培养阳性、脓血便、年龄<5岁病例PCR平均循环数对比，差异有统计学意义（P<0.05），提示脓血便可为判断志贺菌感染程度的指标之一，重症感染为肠上皮黏膜破裂引起病原菌快速、大量增殖所致。相对于轻症病例，重症感染者的排泄物中细菌载量更高。PCR检测可以避免重复检测带来的繁复工作量，且解决了细菌培养受细菌载量、细菌竞争抑制等因素的影响而造成的检出率偏低。

综上所述，PCR检测ipaH基因有利于准确评估人群中细菌痢疾的发病率，具有一定的临床应用价值，值得借鉴。

参考文献：

[1]许丽霞，黄剑芳，刘集鸿.细菌培养与聚合酶链反应（PCR）检测在细菌性痢疾检测中的应用分析[J].检验医学与临床，2014，15（12）：1676-1677.

[2]王蒋丽，李彩云，曾强，等.荧光PCR法与细菌培养法在食源性致病检测中的应用[J].中国卫生检验杂志，2015，21（10）：2498-2499.

[3]王晶晶，陈爱英，阎碧茹.211例细菌性痢疾便标本细菌培养及药敏试验结果[J].山西医科大学学报，2015，29（2）：125-127.

[4]曾桂芬，龙北国，姜容，等.LAM和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较[J].热带医学杂志，2014，12（5）：547-549

[5]王国富，吴利先，薛士鹏.志贺菌感染的多重PCR快速诊断技术的建立[J].中国现代药物应用，2015，6（12）：130-135.

收稿日期：2019-4-18;修回日期：2019-4-28

编辑/冯清亮