邢宇双 郑科文 梁启超 吴宜艳 赵玉佳

[摘要] 目的 觀察并探究针刺治疗大鼠酒精戒断焦虑症的作用及其机制。 方法 选取SPF级健康雄性SD大鼠54只，采用完全随机分组方法将其分为空白组、模型（酒精戒断焦虑症模型）组、三阴交组、足三里组、电针两穴（三阴交+足三里）组、针刺两穴（三阴交+足三里）组，每组9只。除空白组外，其余各组均连续腹腔注射酒精28 d制备酒精成瘾模型，撤酒精3 d制备酒精戒断焦虑症模型，撤酒精期间分别针刺相应穴位进行治疗，针刺3 d。采用高架十字迷宫（EPM）测其焦虑行为，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测海马中促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）浓度，实时荧光定量PCR法检测海马中CRH mRNA的表达。 结果 与空白组比较，模型组进入开放臂次数比例和停留时间比例明显减少（P < 0.05），海马中CRH浓度明显升高（P < 0.01），CRH mRNA的表达显著升高（P < 0.01）;与模型组比较，电针两穴组在EPM中进入开放臂次数比例、停留时间比例明显增加（P < 0.05或P < 0.01），针刺两穴组进入开放臂次数比例增加（P < 0.05），电针两穴组和针刺两穴组海马中CRH浓度明显降低（P < 0.01），CRH mRNA表达亦显著降低（P < 0.05或P < 0.01），而单穴位组对各监测指标的作用效果不明显（P > 0.05）。结论 针刺能缓解酒精戒断焦虑症大鼠的焦虑，其抗焦虑的作用可能与调节大鼠海马中CRH的表达有关。

[关键词] 针刺;焦虑;酒精戒断;促肾上腺皮质激素释放激素

[中图分类号] R246.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）09（b）-0012-05

Effect of acupuncture for the treatment of alcohol withdrawal anxiety in rats and its relationship with CRH

XING Yushuang1，2   ZHENG Kewen2   LIANG Qichao2   WU Yiyan2   ZHAO Yujia2

1.Graduate School， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Province， Qiqihar   161006， China; 2.School of Pharmacy， Mudanjiang Medical University， Heilongjiang Province， Mudanjiang   157011， China

[Abstract] Objective To observe and explore the effect and mechanism of acupuncture for the treatment of alcohol withdrawal anxiety in rats. Methods Fifty-four SPF healthy male SD rats were selected and randomly divided into blank group， model （alcohol withdrawal anxiety model） group， sānyīnjiāo group， zúsānlǐ group， electro-acupuncture two-point （sānyīnjiāo + zúsānlǐ） group， acupuncture two-point （sānyīnjiāo + zúsānlǐ） group， with 9 rats in each group. Except the blank group， all the other groups were given continuous intraperitoneal injection of alcohol for 28 days to prepare the alcohol addiction model， withdrawal of alcohol for 3 days to prepare the alcohol withdrawal anxiety model， and they were respectively given acupuncture at corresponding points during withdrawal of alcohol for 3 days. The elevated plus-maze （EPM） test was used to measure the anxiety behavior. The enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure the concentration of corticotropin releasing hormone （CRH） in the hippocampus. The real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of CRH mRNA in hippocampus. Results Compared with the blank group， the percentage of number and residence time of the model group staying in the open arms were significantly reduced （P < 0.05）， the concentration of CRH in the hippocampus was significantly increased （P < 0.01）， the expression of CRH mRNA was significantly increased （P < 0.01）; compared with the model group， the percentage of number of entering the open arm and residence time staying in the open arm during EPM test of the electro-acupuncture two-point group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， the percentage of number entering the open arm during EPM test of the acupuncture two-point group was significantly increased （P < 0.05）， CRH concentrations in hippocampus of the electro-acupuncture two-point group and the acupuncture two-point group were significantly decreased （P < 0.01）， and CRH mRNA expression in hippocampus was also significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. However， the effect of single acupoint group on each monitoring index was not significant （P > 0.05）. Conclusion Acupuncture can relieve the anxiety of rats with alcohol withdrawal anxiety， and its anti-anxiety effect may be related to the regulation of CRH expression in the hippocampus of rats.

[Key words] Acupuncture; Anxiety; Alcohol withdrawal; Corticotropin releasing hormone

酒精依赖可导致多种躯体和精神疾病，不仅损害个人健康，更是家庭暴力以及犯罪的重要根源[1]。酒精戒断综合征主要表现为不同程度的焦虑症状[2]，这种焦虑症状是导致复饮的重要风险因素。在焦虑样症状的产生及表达中，常伴随着促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）-促肾上腺皮质激素（ACTH）-肾上腺内分泌反应轴的功能亢进[3-4]。CRH调节内分泌、自主神经、中枢神经和行为反应，是机体应答应激刺激的重要神经肽[5-6]。研究发现，CRH在介导大鼠酒精焦虑样症状中起着非常重要的作用[7-8]。

针刺作为我国传统医学的两大支柱之一，具有疗效稳固、操作安全简单、无成瘾性等优点，自古以来被广泛用于成瘾药物的脱敏和脱毒治疗。研究显示针刺可缓解焦虑症状[9-10]。近年来，一些国内外学者证明了针刺疗法对酒精依赖的治疗效果[11]，为针刺疗法在酒精依赖中的应用提供了强有力的临床支持。传统医学认为，焦虑症之神志不安多由脏腑功能失调、气机失常所致，涉及到心、肝、脾、肾。足三里为足阳明胃经合穴，三阴交为足三阴经的交会穴，具有疏肝调肝、健脾化痰、补虚培元的作用，对治疗焦虑症状具有很好的效果。研究证实，针刺足三里和三阴交穴可调节大脑纹状体和伏隔核多巴胺神经的兴奋性，抑制大鼠过度运动、肌肉僵硬和震颤等酒精戒断机体症状[12]。近几年张雅红等[13]在国家自然科学基金项目资助下，完成了电针治疗改善酒精依赖住院患者情绪的研究。

综上所述，本研究欲在动物实验水平上观察针刺三阴交、足三里对大鼠酒精戒断焦虑症的治疗作用，并探究其与CRH之间的关系，为针刺疗法防治酒精复饮提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物  SPF级雄性SD大鼠54只，重量220～250 g。哈尔滨医科大学动物实验中心提供，质量合格证号：23001700000704。实验动物饲养在SPF级实验室，温度（22.0±2.0）℃，食物和水供应充足。

1.1.2 实验试剂  CRH酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒：纪宁实业（A04310）;RNA提取试剂盒：美国欧米伽公司Omega（R6731-02）;逆转录试剂盒：美国Invitrogen公司（4374967）;SYBR Green荧光染料：美国ORIGENE公司（AGF1380A）;PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 实验仪器  针刺针（华佗牌）：广州得源医疗器械有限公司;电针仪（BT701-1B）：上海华谊医用仪器有限公司;旋涡混合器（XH-D）：上海比朗仪器有限公司;高架十字迷宫（EPM）：上海欣软信息科技有限公司;微型离心机（Mini-10K）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;PCR自动系列化分析仪（S1000）：美国Bio-Rad;实时荧光定量PCR：美国应用生物系统公司;RNA浓度分析仪（NanoDrop 2000）：美国Thermo scientific;超净工作台（ESCO ACB-4A1）：上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酒精成瘾模型的建立及治疗  选取健康SD大鼠54只，体重220～250 g，采用完全随机分组方法[14]，将其随机分为空白组（生理盐水）、模型组（20%酒精）、电针两穴组（20%酒精+电针单侧足三里、三阴交）、针刺两穴组（20%酒精+针刺单侧足三里、三阴交）、三阴交组（20%酒精+针刺单侧三阴交）、足三里组（20%酒精+针刺单侧足三里），每组9只。除空白组外，其余五组每天腹腔内注射20%（W/V）乙醇1.5 mL/100 g，共28 d，制备酒精成瘾模型，撤酒精3 d，制备酒精戒断焦虑征模型。撤酒精期间分别针刺相应的穴位进行治疗，治疗前先将大鼠固定在自制的绑鼠台上，用酒精进行消毒，电针两穴组进行治疗时，针刺单侧足三里、三阴交，针柄接上电针仪，选用疏密波，频率为15～25 Hz，电流为1～2 mA，刺激的强度以大鼠被针刺侧的下肢轻微颤抖为度。每天进行1次，每次针刺30 min，连续治疗3 d。空白组和模型组在相同的时间内进行与针刺组相同的固定，但不进行针刺治疗。

1.2.2 行为学指标测试  实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温24℃，保持安静。将每只大鼠置于高架十字迷宫（EPM）的正中央释放，测试时间为5 min。每只动物完成测试后，清理粪便，并对装置用酒精进行彻底清洁消毒。测试指标：进入开放臂次数（OE）：即进入到任一开放臂的次数，以大鼠4个爪均进入到臂内开始，中途有1个爪从该臂中完全撤出，视为该次进入活动完成;进入开放臂时间（OT）：从进入到退出开放臂，在开放臂内停留的时间;进入闭合臂次数（CE）：即进入到任一闭合臂的次数，以大鼠4个爪均进入到臂内开始，中途有1個爪从该臂中完全撤出，视为该次进入活动完成;进入闭合臂时间（CT）：从进入到退出闭合臂，在臂内停留的时间。由以上指标分别计算出：①进入开放臂次数比例（OE%）=OE/（OE+CE）×100%;②开放臂停留时间比例（OT%）=OT/（OT+CT）×100%。

1.2.3 ELISA检测CRH浓度  使用前将试剂盒在室温下平衡30 min。配置标准品稀释液，浓度分别为480、240、120、60、30 nmol/L。取海马，称重，匀浆，离心，取上清，待测。空白孔不加样，只加显色剂A、B和终止液用于调零;标准品孔，每孔加入稀释好的标准品50 μL，零孔加入标准品/样品稀释液50 μL，然后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）试剂50 μL;样品孔，加入样品50 μL，然后加入HRP试剂50 μL。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60 min。洗涤5次，拍干。在每个孔内先加入显色剂A 50 μL，随后加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡以混匀，37℃下避光显色，显色10 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光值（OD值）。测定在加入终止液后的10 min内进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR法  ①海马组织中总RNA的提取。用加入β-巯基乙醇的Buffer GTC裂解海马组织，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水，充分混匀。加入蛋白酶K进行裂解，并充分混匀，在55℃水浴锅中温育10 min。在室温下，离心样品，将上清液加入gDNA柱，离心。在裂解产物中加入50%体积的无水乙醇，混匀。样品转入到HiBind RNA Mini Column上，室温离心，弃去液体。用RNA wash Buffer Ⅰ、RNA wash Buffer Ⅱ洗柱。用65℃水浴锅预热的DEPC水洗脱柱子，离心。②逆转录为cDNA。10 μL的RNA template（2 μg/μL）、3 μL的RT引物工作液（62.5 nmol/L）混合，离心，然后放入PCR仪中，在65℃下，反应10 min。随后冰浴2 min。4 μL的RT buffer（5×）、0.5 μL的RNase inhibitor（40 μg/μL）、2 μL的dNTP mix（2.5 mmol/L）、0.5 μL的RT酶（200 μg/μL）混合，离心，然后放入PCR仪中，在25℃下，反应10 min，然后在50℃下，反应1 h，最后在85℃条件下，反应5 min。将逆转录所得cDNA稀释5倍，在-20℃冰箱中储存备用。③实时荧光定量PCR 20 μL反应体系：9 μL SYBR Green Mix、7.4 μL ddH2O、2 μL cDNA、0.8 μL Reverse Primer（10 μmol/L）、0.8 μL Forward Primer（10 μmol/L）。本实验中的内参基因选用β-actin。实验中使用的所有引物均由生工生物工程上海有限公司合成并质谱检测，β-actin的上游引物序列：5′-TGACGTGGACATCCGCAAA-3′，下游引物序列：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′;MTA1的上游引物序列：5′-CGCAGCCGTTGAATTTCTTG-3′，下游引物序列：5′-GCGGGACTTCTGTTGAGGC-3′。④实时荧光定量PCR反应。在RT-PCR仪中，将SYBR Green，cDNA产物以及引物混合进行扩增，以β-actin作为内参基因，反应条件为：95℃条件下预变性，反应10 min;95℃条件下变性，反应15 s;60℃条件下退火，反应1 min;95℃条件下变性，反应15 s和60℃条件下退火，反应1 min，重复40个循环，反应结束后，扩增结束。每个样本做3个复孔。用2-ΔΔCt计算mRNA表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0对所得数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用單因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺治疗对大鼠OE%和OT%的影响

在EPM测试中，与空白组比较，模型组OE%和OT%明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）;与模型组比较，电针两穴组可显著增加OE%和OT%，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），针刺两穴组能增加OE%，差异有统计学意义（P < 0.05），而单穴位治疗组作用效果不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1   针刺治疗对大鼠OE%、OT%的影响（x±s）

注：与空白组比较，*P < 0.05;与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。OT%：开放臂停留时间比例;OE%：进入开放臂次数比例

2.2 针刺治疗对大鼠CRH浓度的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马中CRH浓度显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与模型组比较，电针两穴组与针刺两穴组可明显降低海马中CRH浓度，差异有高度统计学意义（P < 0.01），而单穴位治疗组降低CRH浓度的趋势不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2   针刺治疗对大鼠CRH浓度的影响（nmol/L，x±s）

注：与空白组比较，**P < 0.01;与模型组比较，##P < 0.01。CRH：促肾上腺皮质激素释放激素

2.3 针刺对大鼠CRH mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马中CRH mRNA的表达显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与模型组比较，电针两穴组和针刺两穴组可明显降低海马中CRH mRNA的表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），而单穴位治疗组对CRH mRNA表达的影响不明显，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

与空白组比较，**P < 0.01;与模型组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。CRH：促肾上腺皮质激素释放激素

图1   针刺对大鼠CRH mRNA表达的影响

3 讨论

行为反映了个体所承受的外界刺激的特点，虽然人类与动物的行为活动不能完全对等，但其各自的行为活动与它们的心理及生理的关系十分密切。本研究所采用的EPM是国际公认的检测动物焦虑行为的首选装置[15]。本研究结果显示，酒精戒断大鼠可产生焦虑行为，其在开放臂的停留时间与空白组相比较短，进入开放臂的次数也相对较少。抗焦虑药物可影响EPM的测试结果，该类药物对啮齿类动物的焦虑样行为具有抑制作用[16]。目前，药物治疗是抗焦虑最为直接的治疗方法，在临床上，苯二氮■类药物常用于治疗酒精戒断焦虑症，虽取得了一定的疗效，但随着病情的不断加重，病期的加长，口服药量也会随之相应增加，药物的副作用也随之产生。并且苯二氮■类药物具有成瘾性，其在临床应用上受到了限制，所以研究和开发既无成瘾性又有很好抗焦虑效应的新医疗手段是治疗酒精依赖方面所面临的紧迫任务。针灸具有疗效稳固且无成瘾性等优点，自古以来就被用于成瘾药物的脱敏、脱毒治疗。在目前的研究中，电针两穴、针刺两穴治疗可明显改善酒精戒断期间大鼠的焦虑样行为，而单穴位治疗作用效果不太明显，说明针刺对焦虑的治疗作用与针刺的方式、穴位有关。

大量的研究结果显示，当机体受到内外环境的刺激时，应激反应会表现出一系列的神经内分泌物质的变化，主要表现为下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴的兴奋。下丘脑室旁核是HPA-神经内分泌轴的中枢位点，CRH则是HPA轴激活的关键性物质。研究表明，在应激刺激下，CRH浓度以及CRH mRNA表达均显著增加[17]。在焦虑症状中所观察到的激素含量的变化主要是由CRH的过度分泌所导致的[18]。研究表明，CRH的受体拮抗剂可作为抗焦虑以及抗抑郁的神经药理学治疗方法[19]。边缘系统具有生命脑、内脏脑、情绪脑的称号，与学习、记忆以及情感等具有密切的关系，是较为高级的控制中枢，可作用于内脏与机体的内环境。海马组织的传入神经以及传出神经的调节在成瘾机制的形成、维持方面扮演着重要的角色。边缘系统的主要组成部分之一便是海马，它不仅可以控制并反映情绪，还与认知功能、焦虑作用关系密切[20]。由本研究结果可知，模型组大鼠的海马中CRH浓度以及CRH mRNA表达较空白组大鼠均增加，经针刺治疗后，其数值又趋于正常水平，由此提示，CRH在焦虑的发生中占有重要的地位。

综上所述，本研究提示，针刺可缓解酒精戒断期间的焦虑样行为，其抗焦虑的作用机制可能与CRH浓度以及CRH mRNA表达有关。

[参考文献]

[1]  吕园园，陈宝嫦，许律琴.酒精依赖与双相情感障碍共病患者的临床特征及生活质量调查[J].海南医学，2019，30（8）：1076-1078.

[2]  邢宇双，梁启超，杨志，等.针刺神门穴治疗酒精戒断焦虑征的研究现状[J].世界最新医学信息文摘，2017，17（34）：40-42.

[3]  Paretkar T，Dimitrov E. The Central Amygdala Corticotropin-releasing hormone（CRH）Neurons Modulation of Anxiety-like Behavior and Hippocampus-dependent Memory in Mice [J]. Neuroscience，2018，390：187-197.

[4]  周丹青.LDT中CRF神经元对焦虑与睡眠的调控初探[D].杭州：浙江大学，2016.

[5]  Wang LA，de Kloet AD，Smeltzer MD，et al. Coupling corticotropin-releasing-hormone and angiotensin converting enzyme 2 dampens stress responsiveness in male mice [J]. Neuropharmacology，2018，133：85-93.

[6]  Daviu N，Bruchas MR，Moghaddam B，et al. Neurobiological links between stress and anxiety [J]. Neurobiol Stress，2019，11：100191.

[7]  杨建飞，王红，郑祖艳.头皮丛刺对焦虑模型大鼠HPA轴CRH、ACTH作用及分子机制研究[J].针灸临床杂志，2018，34（10）：55-58.

[8]  Savarese A，Lasek AW. Regulation of anxiety-like behavior and Crhr1 expression in the basolateral amygdala by LMO3 [J]. Psychoneuroendocrinology，2018，92：13-20.

[9]  姚弘.针刺调节焦虑模型大鼠下丘脑C型利钠肽受体的机制研究[D].成都：成都中医药大学，2016.

[10]  梁花花，王亞军.近10年国内外针刺治疗焦虑症研究进展[J].中华中医药杂志，2019，34（3）：1131-1133.

[11]  Cho SH，Whang WW. Acupuncture for alcohol dependence：a systematic review [J]. Alcohol Clin Exp Res，2009， 33（8）：1305-1313.

[12]  Kim JH，Chung JY，Kwon YK，et al. Acupuncture reduces alcohol withdrawal syndrome and c-Fos expression in rat brain [J]. Am J Chin Med，2005，33（6）：887-896.

[13]  张雅红，张瑞国，陈云春，等.电针治疗对酒精依赖住院患者情绪改善的影响[J].中国民康医学，2010，22（10）：1197-1198.

[14]  赵伟，孙国志.常用实验动物随机分组方法[J].畜牧兽医科技信息，2009（4）：61-62.

[15]  宗绍波，魏盛，苏云祥，等.焦虑大鼠模型高架十字迷宫实验的复测信度检验及参数相关性分析[J].中国医药导报，2011，8（30）：5-7.

[16]  Sj？觟stedt C，Ohlsson H，Li X，et al. Socio-demographic factors and long-term use of benzodiazepines in patients with depression，anxiety or insomnia [J]. Psychiatry Res，2017，249：221-225.

[17]  He JJ，Chen XQ，Wang L，et al. Corticotropin-releasing hormone receptor 1 coexists with endothelin-1 and modulates its mRNA expression and release in rat paraventricular nucleus during hypoxia [J]. Neuroscience，2008， 152（4）：1006-1014.

[18]  Holsboer F，Ising M. Central CRH system in depression and anxiety--evidence from clinical studies with CRH 1 receptor antagonists [J]. Eur J Pharmacol，2008，583（2/3）：350-357.

[19]  Ising M，Holsboer F. CRH-sub-1 receptor antagonists for the treatment of depression and anxiety [J]. Exp Clin Psychopharmacol，2007，15（6）：519-528.

[20]  严文霞，徐卫红，陈旭，等.环境浓度壬基酚暴露对大鼠焦虑行为及其海马组织形态的影响[J].重庆医学，2019， 48（3）：382-385.

（收稿日期：2019-04-19  本文编辑：张瑜杰）