朱晓翠 宫倩红

摘 要 透明质酸酶是广泛分布于自然界的一类糖苷酶，不仅能够作为工具酶制备低分子量透明质酸和透明质酸寡糖，还可用于促进药物吸收以及创伤后局部水肿消散，因其多种生物学活性而广泛应用于工业和临床。本文对PL-8家族细菌透明质酸酶的三维结构特征和底物的催化作用机制进行综述。

关键词 PL-8家族 透明质酸酶 结构特征 催化作用机制

中图分类号：R285.5 文献标识码：A

透明质酸酶（hyaluronidase， HAase）是一类能够降解透明质酸的糖苷酶，主要降解透明质酸，同时能够在一定程度上降解硫酸软骨素（Chondroitin sulfates， CS）。透明质酸酶由Duran-Reynals在1929年首次发现于哺乳动物睾丸及其他组织提取物中，可作为一种“扩散因子”促进疫苗、染料和毒素扩散。

基于氨基酸序列同源性分析，可以将透明质酸酶分为两大类：真核生物来源透明质酸酶和原核生物来源透明质酸酶。真核生物来源透明质酸酶主要是从动物组织器官（如牛、羊睾丸透明质酸酶等）中提取，但动物组织提取原料有限、纯化工艺复杂、价格昂贵、而且存在病毒感染的风险。原核生物透明质酸酶主要来源于细菌和噬菌体中，来源广泛，纯化工艺简单，成本较低，具有较好的市场应用价值，因此细菌来源透明质酸酶已成为目前的研究热点。在CAZY数据库中，细菌透明质酸裂解酶主要归属于PL-8和PL-16裂解酶家族，但两个家族的透明质酸酶在三维结构和催化机制方面存在明显不同。本文主要对PL-8家族透明质酸酶的三维结构特征和底物的催化作用机制进行综述。

1 PL-8家族三维结构特征

PL-8家族是糖胺聚糖裂解酶家族，目前做过性质研究的共有27种，主要包括透明质酸酶、硫酸软骨素酶和黄原胶酶。目前已经阐明了PL-8家族多种透明质酸酶的X射线晶体结构，研究表明，PL-8家族细菌透明质酸酶主要由三个结构域组成，分别是N端结构域，间隔区和C端结构域。其中结晶的天然肺炎链球菌酶分子由具有（%Z/%Z）5-6的%Z-螺旋桶结构的主要催化结构域和反平行%[折叠组成的C-末端结构域组成。无乳链球菌（S. agalactiae）透明质酸酶的结构类似于肺炎链球菌（S. pneumoniae）透明质酸酶，但N末端包含另外的结构域，起到间隔结构域的作用。C-末端%[-折叠结构域的功能是调节聚合物HA/ Ch / ChS底物进入%Z-螺旋催化结构域中的催化裂缝，整个催化裂缝穿过%Z-螺旋区域，其中六糖单元刚好结合在催化裂缝内酶的活性位点存在于桶状结构的催化裂缝中，由三个残基组成：Asn349，His399和Tyr408。

2底物结合裂缝

PL-8家族细菌透明质酸裂解酶的共同结构特征是它们都有一个细长的底物结合裂缝用于容纳底物。在链球菌透明质酸酶中就存在这样的底物结合裂缝，该酶含有一个由%Z螺旋组成的扭曲的（%Z/%Z）5-6桶，底物结合裂缝嵌套在%Z螺旋中，促进HA结合。在这些结构中，裂缝由从%[-螺旋链的表面延伸的环组成。并且在几种多糖水解酶中也发现了这种%[-螺旋折叠，例如鼠李糖半乳糖醛酸酶A和噬菌体P22的尾部刺突蛋白，这意味着裂缝特异的有利于多糖底物的结合。在一些酶中，裂缝被覆盖以形成特异于细胞水解酶的结构。这种裂缝的这一重要特征是它们主要具有正电性和疏水性，因此促进带负电荷的疏水性HA / Ch / ChS底物的结合。因此该过程由酶和聚合物的相互作用以及它们产生的电荷电势驱动，反应的能量可能由糖苷键降解时发生的放热反应产生。

3催化作用机制

根据文献报道，PL-8家族透明质酸酶的作用机制是%[-消除反应，主要表现为质子接受和捐赠（Proton acceptance and donation， PAD）。

以鏈球菌透明质酸酶为例，催化机制主要分为以下几个步骤：（1）透明质酸底物与酶的底物结合裂缝紧密结合;（2）通过透明质酸酶的Asn作为电子吸收剂酸化HA的葡糖醛酸残基的C5碳原子;（3）通过酶的His残基夺走C5质子，然后在糖苷键的还原侧上的葡糖醛酸的C4和C5之间形成不饱和键;（4）从酶的Tyr残基中提供质子后裂解糖苷键;（5）最后，HA二糖产物从活性位点离开，并通过与水环境的酶交换平衡氢离子，然后酶用于下一轮催化。对于底物的逐步降解，HA通过一个二糖单元向链的还原端移位，并使用PAD机制进行脱水降解。在该过程中，C4和C5碳原子从sp3变为sp2杂交，其中糖环的产物构象发生相应的变化，最后变为半椅式构象。除了三个催化残基外，其他残基还涉及酶作用的重要方面：疏水残基Trp291，Trp292和Phe343，以及Glu388，Asp398和Thr400可能在裂缝末端产生负电位。与底物相互作用的疏水性区域发挥催化作用，而负电荷区域促进产物的释放。

4展望

关于透明质酸酶的研究已有80余年的历史，因其具有多种生物学活性，透明质酸酶已被广泛应用于工业和医疗领域，如制备透明质酸寡糖、眼科治疗、美容整形和促进药物扩散等。由于细菌透明质酸酶来源广泛，纯化工艺简单，且生产成本较低，因此成为近年来的研究热点之一。但有关细菌来源透明质酸酶的催化作用机制、底物特异性和促进皮下药物扩散的作用仍有待深入研究。相信随着研究的进一步深入，细菌来源透明质酸酶将为皮下药物扩散和肿瘤靶向治疗带来新的希望。