任捷　马莉　严淑贤

[摘要]目的：研究紫外线（UV）照射对真皮成纤维细胞功能的影响，观察杜仲提取液对紫外线照射下细胞的保护作用。方法：体外培养人真皮成纤维细胞接收长波紫外线或中波紫外线照射，同时加入杜仲提取液，检测细胞存活率，基质金属蛋白酶（MMP）-1和3的mRNA表达，以及Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白表达水平。结果：与未照射组相比，20J/cm2 UVA1和40mJ/cm2 UVB照射组可显著抑制细胞存活率、增加MMP-1和MMP-3 mRNA水平、抑制Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白表达水平（P<0.01）。照射同时加入1mg/ml杜仲提取液可以显著减少UVA1或UVB照射对细胞引起的上述改变（P<0.05）。结论：杜仲提取液对UV照射所致真皮成纤维细胞的增殖损伤、胶原合成和分解代谢紊乱有保护作用，因而可以应用于防治皮肤光老化。

[关键词]紫外线;皮肤衰老;真皮;成纤维细胞;杜仲提取液

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）10-0099-04

Abstract： Objective To determine the effects of Eucommia ulmoides oliver extracts on ultraviolet irradiated human dermal fibroblasts in vitro. Methods  Human dermal fibroblasts were irradiated by a single exposure to UVA1 or UVB and at the same time incubated with， or without Eucommia ulmoides oliver extracts and then detected twenty-four hours later. Cell viability rate， expressions of MMP-1， MMP-3 and procollagen Ⅰ， procollagen Ⅲ were detected. Results  20J/cm2 UVA1 or 40mJ/cm2UVB significantly inhibited the cell viability rate and procollagen Ⅰ， procollagen Ⅲ protein levels （P<0.01）， while stimulated MMP-1 and MMP-3 mRNA expression （P<0.01）. Eucommia ulmoides oliver extracts reversed these effects caused by UV in some degree and in 1mg/ml concentration （P<0.05）. Conclusion Eucommia ulmoides oliver extracts had photoprotective properties against UV irradiation in vitro， which inhibited extracellular matrix degradation and preserved collagen production in dermis， and might be used as an anti-photoaging agent.

Key words： ultraviolet rays; skin aging; dermis; fibroblast; Eucommia ulmoides  oliver  extracts

光老化是指長期紫外线（Ultraviolet，UV）照射导致的皮肤过早老化，表现为面颈部及手背等光暴露部位皮肤晦暗、粗糙、增厚及粗深皱纹，即皮革样外观[1]。皮肤光老化不仅可损害患者的容貌外观，还与多种皮肤病甚至皮肤肿瘤的发生发展密切相关[2]。光老化机制复杂，其中，氧化应激起核心作用[3]。因此，寻找有效的抗氧化剂是皮肤光老化防治的新研究方向。杜仲是一种天然的抗氧化剂。近年来研究显示，杜仲对羟自由基、超氧阴离子均有较强的清除作用[4]。但杜仲对UV照射下真皮成纤维细胞是否有保护作用，目前尚不明了。本研究以体外培养的人真皮成纤维细胞为观察对象，同时选取UVA1和UVB两种光源，观察杜仲提取液对UV照射人真皮成纤维细胞增殖和功能的影响。

1  材料和方法

1.1 人真皮成纤维细胞培养：取包皮环切术后的人体包皮（供者年龄3～9岁），去除皮下组织，用0.5% Dispase分离真表皮，真皮于0.25%胰酶消化，过滤离心弃上清，加入含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的DMEM培养基（Gibco，美国），置于37℃、5% CO2培养箱内。取第3～8代细胞进行试验。

1.2 紫外线照射：细胞加入安全浓度范围内的杜仲提取液（杜仲饮片购自青浦饮片厂，通过70%的乙醇溶液回流提取2h，过滤浓缩以去离子水定容后得杜仲提取液），培养箱中孵育1h，接受20J/cm2长波紫外线UVA1照射（18根并排PL-9w/10型灯管，Philips，光谱340～400nm，辐照强度10.0mW/cm2），或40mJ/cm2中波紫外线UVB照射（8根交叉排列PL-S 9w/12 H型灯管，Philips，光谱280～320nm，辐照强度2.0mW/cm2）。照射后加入含杜仲提取液的完全DMEM培养液继续孵育24h后检测各项指标。设未加药未照射为对照组。

1.3 CCK-8法检测真皮成纤维细胞增殖活性：用CCK-8（Dojindo，日本）检测真皮成纤维细胞活性和增殖率，细胞各孔加入CCK-8 10?l，于细胞培养箱内培养3h，用酶标仪（激发波长450nm）测定各孔的吸光度（OD值）。细胞存活率为各照射组OD值占对照组OD值的百分比。

1.4 荧光实时定量PCR法检测MMP-1和MMP-3 mRNA表达：细胞接受紫外线照射后24h，吸弃培养液，加入Trizol提取总RNA，参照说明书逆转录cDNA。应用Primer Premier设计引物，由上海生工生物技术公司合成，MMP-1正向引物5-GGCTGTTCAGGGACAGAATGTG-3，反向引物5-GGCCAATTCCAGGAAAGTCAT-3;MMP-3正向引物5-AAGGAAATCAATTCTGGGCTATC-3，反向引物5-TTTGAGTCAATCCCTGGAAAGTC-3;内参β-actin正向引物5-ACCAACTGGGACGACATGGA-3，反向引物5-CCCTCGTAGATGGGCACAGT-3。反应条件：95℃ 3min;95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，40个循环。采用2-△△Ct表示目标基因的相对表达量。

1.5 ELISA法检测Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白表达：紫外线照射后24h，收集细胞培养上清液，采用双抗体夹心ABC-ELISA法，参照试剂盒（Southernbiotech，美国）说明，测定Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白含量。同时收集细胞，取上清液测定细胞蛋白定量。细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白含量由细胞蛋白含量矫正，以ng/mg表示。

1.6 统计学分析：实验结果以（x?±s）表示，采用SPSS 22.0统计分析软件，多重比较采用单因素方差分析LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 杜仲提取液的安全浓度范围：不同浓度杜仲提取液（0.1，1，10，100mg/ml）分別加入细胞培养液孵育。48h后用CCK-8检测各组成纤维细胞存活率，结果示，10mg/ml和100mg/ml组细胞存活率下降，与未加药组相比差异有统计学意义（P<0.01），见图1。同时在倒置显微镜下观察，显示加入上述浓度杜仲提取液48h后，细胞数量减少，轮廓明显，部分细胞皱缩、崩溃溶解。而其它浓度组细胞存活率无显著改变，细胞形态也无明显变化（见图2）。上述结果表明，杜仲提取液安全浓度范围为≤1mg/ml。因此进一步选择安全浓度范围内的杜仲提取液进行后续实验。

2.2 杜仲提取液对UV照射后真皮成纤维细胞增殖活性的影响：真皮成纤维细胞接受20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射24h后，细胞存活率分别为（78.69±4.00）%、（81.61±4.45）%，均较未照射组下降，差异有统计学意义（P<0.01）。照射同时加入安全浓度范围内的杜仲提取液（0.01，0.1，1mg/ml），其中0.1mg/ml和1mg/ml杜仲提取液可以减少UVA1或UVB照射对细胞增殖的抑制作用，与未加药照射组相比，细胞存活率上升，差异有统计学意义（P<0.01）。见图3。

2.3 杜仲提取液对UV照射后真皮成纤维细胞MMP-1、MMP-3 mRNA表达的影响：20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射显著促进了真皮成纤维细胞MMP-1和MMP-3 mRNA的表达（P<0.01）。0.1mg/ml和1mg/ml杜仲提取液可抑制UV照射后MMP-1、MMP-3 mRNA的表达，其中1mg/ml杜仲提取液作用较强（P<0.01）。见表1～2。

2.4 杜仲提取液对UV照射后真皮成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白表达的影响：20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射显著抑制了真皮成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白的表达（P<0.01）。1mg/ml杜仲提取液可显著减少UV照射对细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白表达的抑制作用，与未加药照射组相比，Ⅰ型前胶原蛋白的含量（P<0.01）和Ⅲ型前胶原蛋白的含量（P<0.05）均增高。见表1～2。

3  讨论

到达地球表面对皮肤产生作用的紫外线主要包括中波紫外线（UVB，280～320nm）和长波紫外线（UVA，320～400nm）[5]，其中UVA又可进一步分为UVA2（320～340nm）和UVA1（340～400nm），UVA2的生物学作用与UVB类似，因此本研究选择了UVA1和UVB两种光源。预实验中，真皮成纤维细胞接受20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射后，细胞存活率均在80%左右，且随UV照射剂量升高，细胞存活率进一步下降，因此本研究选择20J/cm2 UVA1和40mJ/cm2 UVB两个照射剂量进行后续检测。

UV引起光老化机制复杂，其中，氧化应激发挥了至关重要的作用[6]。皮肤中的各种光敏物质或色基吸收UV能量后，通过电子传递可产生多种、大量活性氧簇（ROS）[7]。ROS可使细胞DNA损伤[8]、端粒损耗[9]，从而导致基质金属蛋白酶（MMP）表达上调[10]。另一方面，皮肤自身存在能清除ROS的抗氧化酶和非酶自由基清除剂，维持氧稳态[6]。但当大剂量或长期UV照射产生的ROS超过其被清除的能力，稳态失衡[11]，损伤皮肤会产生更多ROS，最终形成光老化的各种表现。可见，补充有效的抗氧化剂是恢复氧稳态的一种方法。

目前，从植物提取物中筛选有效的抗老化成分是研究的热点。杜仲是我国传统的药用植物，具有多种药理作用，如降压、降血脂、降血糖、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等[12]。作为一种天然的抗氧化剂，杜仲对羟自由基、超氧阴离子均有较强的清除作用[4，13]。研究显示，四氯化碳诱导的慢性肝损伤大鼠，口服杜仲提取物可以增加谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，而保护大鼠免受肝损伤[14]。杜仲还可以通过降低晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的氧化应激反应而改善糖尿病小鼠的肾损伤[15]。此外，大鼠皮肤经过UVA照射后，皮肤组织中超氧化物歧化酶、羟脯氨酸含量减少，丙二醛含量增加，而杜仲提取液灌胃组可以明显逆转上述UVA诱导的氧化应激反应[16]。目前已经从杜仲中分离出了多种有效成分，包括木脂素、环烯醚萜类、酚类、甾萜类、黄酮类、多糖类等，这些化合物表现出不同的生物活性，其中酚类和黄酮类具有抗氧化的功效[17]。本研究结果也证实，适当浓度的杜仲提取液能减少UVA1或UVB照射后成纤维细胞增殖抑制程度，显著恢复成纤维细胞存活率。

光老化主要病理改變在真皮层，UV照射即可以刺激MMP的合成和分泌，加速真皮胶原的降解，又能抑制胶原蛋白的合成，不断破坏真皮细胞外基质的结构和功能，最终导致临床上光老化特征性的皮肤粗深皱纹表现。既往研究显示，UV诱导的ROS可导致MMP表达上调，同时抑制胶原的合成[18]。而且UV低于红斑剂量的照射即可促进MMP表达，MMP表达和UV照射剂量之间存在剂量依赖关系[19]。因此不足以导致晒伤的低剂量UV照射，即可促使真皮胶原的降解，从而引起光老化[20]。本研究结果也再次显示，20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射，在促进真皮成纤维细胞MMP-1和MMP-3 mRNA的表达同时，抑制了细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白的表达。UV照射同时加入适当浓度杜仲提取液，却能逆转上述反应，由此再次提示杜仲提取液对UV损伤有保护作用。

杜仲具有清除自由基的抗氧化活性，因此杜仲对UV照射瞬间产生的ROS可能有一定的清除作用，降低了UV照射对成纤维细胞的氧化性损伤，一定程度保护了细胞的正常功能。本研究结果也提示，杜仲对UV照射所致真皮成纤维细胞增殖损伤、胶原合成和分解代谢紊乱有保护作用。由此可见，杜仲作为护肤品或药物成分在防治皮肤光老化中有广泛的应用前景，其具体分子作用机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Young AR，Claveau J，Rossi AB.Ultraviolet radiation and the skin： photobiology and sunscreen photoprotection[J].J Am Acad Dermatol，2017，76（3S1）：S100-S109.

[2]Valejo Coelho MM，Matos TR，Apetato M.The dark side of the light：mechanisms of photocarcinogenesis[J].Clin Dermatol，2016，34（5）：563-570.

[3]Davies JMS，Cillard J，Friguet B，et al.The Oxygen Paradox， the French Paradox， and age-related diseases[J].Geroscience，2017，39（5-6）： 499-550.

[4]Wang CY，Tang L，He JW，et al.Ethnobotany， phytochemistry and pharmacological properties of eucommia ulmoides： a review[J].Am J Chin Med，2019，47（2）：259-300.

[5]Christensen L，Suggs A，Baron E.Ultraviolet photobiology in dermatology[J].Adv Exp Med Biol，2017，996：89-104.

[6]Kammeyer A，Luiten RM.Oxidation events and skin aging[J].Ageing Res Rev，2015，21：16-29.

[7]Birch-Machin MA，Bowman A.Oxidative stress and ageing[J].Br J Dermatol，2016，175（Suppl 2）：26-29.

[8]Natarajan VT，Ganju P，Ramkumar A，et al.Multifaceted pathways protect human skin from UV radiation[J].Nat Chem Biol，2014，10（7）：542-551.

[9]Fouquerel E，Opresko PL.Convergence of the nobel fields of telomere biology and DNA repair[J].Photochem Photobiol，2017，93（1）：229-237.

[10]Zheng Y，Xu QF，Chen HY，et al.Inhibition of MMPs Cat G and downregulates the signaling of TGF-β/Smad in chronic photodamaged human fibroblasts[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（22）：5160-5165.

[11]Brand RM，Wipf P，Durham A，et al.Targeting mitochondrial oxidative stress to mitigate UV-induced skin damage[J].Front Pharmacol，2018，9：920.

[12]Zhu MQ，Sun RC.Eucommia ulmoides oliver： a potential feedstock for bioactive products[J].J Agric Food Chem，2018，66（22）：5433-5438.

[13]Liu B，Li CP，Wang WQ，et al.Lignans extracted from eucommia ulmoides Oliv. protects against AGEs-induced retinal endothelial cell injury[J].Cell Physiol Biochem，2016，39（5）：2044-2054.

[14]Lee HY，Lee GH，Yoon Y，et al.R. verniciflua and E. ulmoides extract （ILF-RE） protects against chronic CCl4-induced liver damage by enhancing antioxidation[J]. Nutrients，2019，11（2）：E382.

[15]Do MH，Hur J，Choi J，et al.Eucommia ulmoides ameliorates glucotoxicity by suppressing advanced glycation end-products in diabetic mice kidney[J].Nutrients，2018，10（3）：E265.

[16]孙琪，祁永华，吴迪，等.基于代谢网络技术的杜仲治疗皮肤光老化的靶向研究[J].中国美容医学，2017，26（8）：70-73.

[17]He X，Wang J，Li M，et al.Eucommia ulmoides Oliv.： ethnopharmacology， phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine[J].J Ethnopharmacol，2014，151（1）：78-92.

[18]Lephart ED.Skin aging and oxidative stress： Equol's anti-aging effects via biochemical and molecular mechanisms[J].Ageing Res Rev，2016，31：36-54.

[19]Pittayapruek P，Meephansan J，Prapapan O，et al.Role of matrix metalloproteinases in photoaging and photocarcinogenesis[J].Int J Mol Sci，2016，17（6）： E868.

[20]Bosch R，Philips N，Suárez-Pérez JA，et al.Mechanisms of photoaging and cutaneous photocarcinogenesis， and photoprotective strategies with phytochemicals[J].Antioxidants（Basel），2015，4（2）：248-268.

[收稿日期]2019-07-22

本文引用格式：任捷，馬莉，严淑贤.杜仲提取液对紫外线照射下真皮成纤维细胞保护作用的研究[J].中国美容医学，2019，28（10）：99-102.