包莉莉，杨波，王冬雪，程立立

(中国人民解放军联勤保障部队第九八零医院生殖医学中心，石家庄 050000)

在IVF/ICSI促排卵方案中，GnRH-a长方案因为能够有效抑制早发LH峰，避免因自发排卵导致的周期取消，多年来一直是促排卵的主流方案。也因为长方案对垂体降调节导致的内源性LH抑制，同时在促排卵过程中大量FSH的添加，使得FSH与LH的比值与自然周期中二者比值极为不同，而这一变化对卵母细胞质量产生怎样的影响尚未可知。随着人们认知的不断深入，很多学者认为LH的添加能够使得长方案中激素的变化更趋近自然从而改善卵子质量及妊娠结局[1]。临床上应用最多的尿源性人绝经期促性腺激素(HMG)，存在以下缺点：LH活性水平不稳定，含有无效成分，不同药品批次间存在差异，及过敏反应等。而r-LH因为价格昂贵，半衰期短，在国内一直没能成为取代HMG的主流用药。高纯度HMG(HP-HMG)含有75 U 的FSH，以及9.9 U HCG和0.4 U LH共同驱动达到75 U的LH活性。1 U HCG 相当于6～7 U LH活性，且HCG的半衰期为31 h，长于LH的13 h[2]，并以其纯度高、稳定性好、副反应小的优势已逐渐替代尿源性HMG在临床中的应用。虽然LH的添加在长方案促排卵过程中已经达到专家的共识，但何时添加LH可以最大程度发挥LH在卵母细胞发育过程中的作用、改善卵母细胞以提高临床妊娠率，成为近年来临床医生所关心的热点。本实验就长方案促排卵过程中HP-HMG不同的添加时机对鲜胚移植周期中各项指标的影响做了对比分析。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析于2016年1月至2017年12月在我院生殖中心应用黄体期GnRH-a长方案促排卵方案进行IVF/ICSI -ET治疗的卵巢储备功能正常的424例不孕患者病例资料。不孕病因包括盆腔输卵管因素、排卵障碍、男方因素、不明原因等。纳入标准：(1)年龄20～36岁；(2)双侧卵巢基础窦卵泡总数8～20个；(3)基础FSH<10 U/L；(4)基础E2<183.5 pmol/L；(5)月经周期介于25至35 d之间。排除标准：(1)严重原发性疾病及生殖器异常；(2)自身免疫系统疾病；(3)子宫平滑肌瘤、子宫内膜异位症等疾病；(4)内分泌代谢性疾病；(5)PCOS；(6)既往IVF/ICSI治疗史。

二、研究方法

1.分组：424例患者根据HP-HMG不同的添加时机分为两组：全程添加HP-HMG为A组(n=141)；中卵泡期添加HP-HMG为B组(n=283)。

2.黄体期GnRH-a长方案促排卵方案：从前次月经周期排卵后的第7天开始每日给予达菲林(注射用醋酸曲普瑞林，益普生，法国)0.1 mg，皮下注射18 d左右，监测各项激素包括雌二醇(E2)、孕酮(P)、LH的变化，同时阴道超声监测窦卵泡直径、子宫内膜厚度，达到降调节标准(E2<183.5 pmol/L，LH<1.0 U/L，子宫内膜厚度<5 mm)后启动促性腺激素(Gn)，达菲林剂量改为每日0.05 mg至HCG日。

促排卵用药A组给予rFSH(果纳芬，雪兰诺，瑞士)75～150 U+HP-HMG(辉凌，德国)75 U促排卵启动，B组给予rFSH 150～225 U促排卵启动。当阴道超声显示双侧卵巢出现卵泡直径大于12 mm的卵泡时添加HP-HMG 75 U。当阴道超声显示双侧卵巢直径18 mm以上的卵泡数占直径14 mm以上的卵泡数的60%以上、直径14 mm以上卵泡的E2平均值为734～1101 pmol/L时，当日晚给予注射用重组人HCG(艾泽，雪兰诺，德国)250 μg皮下注射，35～36 h后取卵。

3.胚胎移植及黄体支持：目前我中心鲜胚移植均为D3卵裂胚，即取卵后72 h对于符合新鲜周期移植标准的患者进行卵裂胚移植，剩余胚胎继续培养形成囊胚后采用玻璃化冷冻的方法进行保存。鲜胚移植标准：取卵数<20枚，P<4.75 nmol/L，取卵后3 d超声显示双侧卵巢直径不超过8 cm，内膜厚度>8 mm，且患者无不适症状。自取卵日即每天肌注黄体酮注射液20 mg、口服地屈孕酮20 mg 2次/日支持黄体功能，

4.妊娠判断：移植后14 d检测血清β-HCG水平，如HCG>10 U/L继续黄体支持，待移植后28 d进行阴道超声检查，观察孕囊个数，着床部位、胚芽、原始心管搏动，见孕囊者确定为临床妊娠。

5.观察指标及判定标准：Gn天数、Gn量；HCG日LH、 E2及P水平；HCG日子宫内膜厚度；平均获卵数；MⅡ卵数，MⅡ卵率(MⅡ卵数/总获卵数×100%)；正常受精率(双原核受精卵数/MⅡ卵数×100%)；优质胚胎率(优质胚胎数/双原核受精卵数×100%)；鲜胚移植率(移植周期数/取卵周期数×100%)；临床妊娠率(临床妊娠周期数/移植周期数×100%)；流产率(流产周期数/临床妊娠周期数×100%)；种植率(着床胚胎数/移植胚胎数×100%)；高反应发生率(>15个获卵的周期数/取卵周期数×100%)；孕酮升高率(HCG日孕酮≥4.75 nmol/L的周期数/取卵周期数×100%)；OHSS发生率(发生中重度OHSS例数/取卵周期数×100%)。

三、统计学处理

结果

一、两组患者一般情况比较

两组患者平均年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础窦卵泡数(AFC)、基础激素水平及不孕因素所占比例均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、两组患者的促排卵临床数据

两组患者的Gn用量及Gn天数、注射HCG日E2水平及子宫内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)；HCG日P水平A组显著低于B组(P<0.05)(表2)。

三、两组患者IVF实验室数据及妊娠结局比较

A组的获卵数、流产率、高反应发生率略差于B组，而正常受精率、优质胚胎率、临床妊娠率、种植率均优于B组，但均无统计学差异(P>0.05)；A组鲜胚移植率显著高于B组(P<0.05)；A组中无人发生孕酮水平升高及中重度OHSS，而B组中分别有38人和9人发生孕酮水平升高和中重度OHSS，差异有统计学意义(P<0.05) ；两组患者的流产率无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表1 两组患者基本情况比较[(-±s)，n(%)]

表2 两组患者的促排卵临床数据(-±s)

注：与A组比较，*P<0.05

表3 两组患者IVF实验室数据及妊娠结局 [(-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05

讨论

在自然周期中早卵泡期虽然卵泡颗粒细胞表面没有LH受体，但卵泡膜细胞表面已经存在着LH受体，也就是说在卵泡直径<10 mm的时候，LH在卵泡内的含量虽低，却有着不可或缺的作用，将毛细血管中的胆固醇转化为雄激素，为颗粒细胞在FSH作用下合成雌激素提供底物，促进颗粒细胞的增殖[3]。而经典的GnRH-a长方案在对垂体进行降调节，在避免产生早发LH峰的同时，也使得整个促排卵过程中LH水平过低，使得在促排卵过程的后期LH的不足导致代谢合成途径从Δ5途径向Δ4途径转变，导致孕酮合成的增加，使得子宫内膜提前转化，胚胎着床的窗口期过早关闭，临床妊娠率明显下降[4]。因此，在长方案促排卵过程中及时补充LH，以期能够促进卵泡的成熟和降低孕酮水平，这已经成为生殖医生的共识[5-6]，但由于促排卵方案多元化，添加时机的选择仍然存在争议，马亚兰等[7]认为在拮抗剂方案中对于卵巢储备功能正常的患者，在中晚卵泡期添加HP-HMG的患者比全程添加的患者成熟卵率、优胚率及临床妊娠率更高。而本实验中两组长方案均添加HP-HMG，根据添加时机不同进行分组，详细比较了两组之间促排卵的各项指标，全程添加HP-HMG组可以有效降低孕酮升高导致的鲜胚周期的取消率，且大大降低OHSS发生率。

本实验中两组黄体期GnRH-a长方案促排卵方案均添加HP-HMG，仅仅因为时机不同使得孕酮水平产生差异，与王凤等[8]在改良超长方案中得到的结论相同。分析原因可能全程添加组HP-HMG通过含有9.9 U的HCG发挥LH的生物学活性，在卵泡发育的早期就能结合膜细胞LH受体，将孕酮顺利转化为雄激素，进而生成雌激素，避免了因为孕酮过早升高所导致的子宫内膜提前转化，种植窗提前关闭；同时可能由于HCG的半衰期长，在连续使用6 d时HCG的血药浓度可达到最大浓度且保持稳定，而Gn 6 d时卵泡正处于中卵泡期，LH的需求逐渐增高，此时发挥LH的最大生物学效应，能够有效地避免因为LH不足导致的孕酮升高。而半程添加组在中卵泡期才开始添加HP-HMG，因为使用时间短，使得HCG的叠加作用未得到充分利用，因此仍会有孕酮合成的增多。本研究发现，全程添加组不仅孕酮水平明显低于半程添加组(1.97 nmol/L vs.3.33 nmol/L)，而且因孕酮升高取消移植率也明显低于半程添加组(0 vs.13.42%)，与Andersen等[9]进行的全球多中心随机对照研究结论一致。

全程添加组的获卵数略低于半程添加组，可能是由于早卵泡期卵泡在全程添加组HP-HMG中FSH和LH协同作用下共同发育，减少了优势卵泡的募集[10]。并且随着使用时间的延长，HCG作用的累加，在中卵泡期LH水平达到一个相对稳定的浓度，使得优势卵泡进一步发育成熟，同时抑制中小卵泡生长，使其闭锁，使得获卵数降低，从而有效地减少OHSS发生率[11]。本研究中全程添加组的高反应率略低于半程添加组，考虑因为样本量少的原因，但OHSS发生率明显低于半程添加组(0 vs.3.18%)。

基于较低的孕酮水平以及较少的获卵数这两个明显的优势，使得全程添加组的鲜胚移植率明显高于半程添加组(70.92% vs.51.24%，P<0.05)，且临床妊娠率略高于半程添加组(74.00% vs.63.44%)，虽然差异无统计学意义(P>0.05)。本研究结果与其他学者认为通过HP-HMG的持续添加，血清中HCG水平与优胚率及活产率成正相关[12]结论一致。

HP-HMG的全程使用使得全程添加组中LH水平在Gn 6 d时达到一个相对稳定的浓度[13]，使得FSH/LH的比值更接近于自然周期，而全程添加组的优胚率较半程添加组有增高的趋势，虽然无统计学意义，可能因为样本量少的原因。子宫内膜同样存在LH受体[14]，可能通过作用于胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)刺激子宫内膜血管生成和内膜生长，从而改善子宫内膜血运及容受性[4]。

目前关于冻融胚胎移植的利弊认识尚未统一。除PCOS患者冻融胚胎移植能够明显提高活产率[15]外，冻融胚胎移植相对于鲜胚移植不仅在胚胎处理上多了冷冻/复苏步骤，胚胎接触了更多的化学试剂，增大了变异及损伤的可能性；另一方面，也增加了患者的花费以及等待的时间。在我国目前试管婴儿完全自费的情况下，如果在安全且临床妊娠率得到保证的情况下，鲜胚移植无疑有着更大的优势。而本实验中的全程添加组由于HP-HMG的全程使用，不仅有效地降低了OHSS发生率，而且有效地避免因孕酮升高导致的新鲜周期取消，且临床妊娠率也有升高趋势，值得进一步扩大样本量在临床推广。