汪 菁，徐晶晶，陈 玲，刘 文，宋雅娴，胡 月，彭亚琴，吴丽敏，公颜平，于 婷

随着DNA测序技术的发展，更多基于测序的分子诊断方法越来越成熟，基于高通量测序的基因组拷贝数变异(CNV-Seq)是其中一种新兴的应用于产前诊断的检测方法，有助于检测出染色体的微缺失和微重复，提高染色体异常检出率。现对进行产前诊断的高龄孕妇羊水样本同时进行染色体G带核型分析和CNV-Seq检测，对该检测数据进行回顾性分析，旨在探讨CNV-Seq是否能够有效提高高龄孕妇染色体异常检出率，从而达到降低高龄妊娠出生缺陷率的目的。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2018年1～8月在中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)产前诊断中心进行产前诊断的80例孕周为18周+3～28周、年龄为35～45岁的高龄孕妇，通过羊膜腔穿刺术获取羊水样本80份，同时进行染色体G显带核型分析和CNV-Seq检测，孕妇签署产前诊断和CNV-Seq知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1羊膜腔穿刺 孕妇在B超引导下，由具有产前诊断资质的医师行羊膜腔穿刺术，每个孕妇抽取3管羊水，每管10 ml，共30 ml羊水，其中2管羊水进行细胞培养，供染色体核型分析，剩余1管进行CNV-Seq检测。

1.2.2染色体G显带核型分析 抽取20 ml羊水进行细胞接种，每个孕妇的样本进行两线培养，培养至7 d左右显微镜下观察细胞状态，换液培养，1～2 d后进行细胞收获、染色制片、核型分析。

1.2.3CNV-Seq检测 抽取10 ml羊水，样本由华大基因公司完成CNV-Seq，该检测针对染色体非整倍体变异和100 kb以上的CNV，其方法如下：使用DNAeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)从羊水细胞中分离基因组DNA，使用50 ng基因组DNA作为起始模板，构建测序文库，最后在BGISEQ-500测序仪上进行测序。使用Burrows-Wheeler Aligner(Version0.7.7)比对软件将读序信息与人类参考基因组(GRCh37,UCSC release hg19)进行比对、分析得到生物信息学结果，判断是否存在染色体非整倍体变异和CNV，并通过ISCA、Decipher、Clinvar等数据库查询，对检测到的CNV的致病性进行评估。

1.3 随访对所有孕妇进行电话随访，追踪妊娠结局及新生儿健康状况。

2 结果

2.1 染色体G显带核型分析结果本研究对80例高龄孕妇同时进行了羊水细胞染色体核型分析和羊水CNV-Seq检测，染色体核型分析检测出13例异常核型，其中21三体6例，18三体3例，性染色体非整倍体异常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，低比例嵌合2例(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，染色体异常检出率为16.25%，致病性异常检出率为13.75%。见表1。

2.2 CNV-Seq检测结果CNV-Seq检测结果致病性染色体异常例数14例，异常检出率17.5%，其中21三体6例，18三体3例，性染色体非整倍体异常2例(1例是47,XXX，1例是47,XXY)，明确致病性染色体微缺失2例，可能致病性染色体微缺失1例，临床意义未明的染色体微缺失、微重复 39例，致病性染色体异常检出率为17.5%，在染色体G显带核型分析结果基础上致病性染色体异常检出率增加了3.75%。

2.3 染色体G显带核型分析联合CNV-Seq检测结果染色体G显带核型分析联合CNV-Seq检测的致病性异常例数为14例，致病性异常检出率为17.5%，比单一的染色体G显带核型分析高出3.75%。染色体G显带核型分析比CNV-Seq检测额外检出了2例小于10%的低比例嵌合(46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]；47,XN,+2[10]/46,XN[120])，CNV-Seq检测比染色体G显带核型分析额外检出了2例明确致病性染色体微缺失和1例可能致病性染色体微缺失(表2)，两种方法对于其他染色体非整倍体异常的检出结果一致。

表1 染色体核型异常结果及其相应CNV-Seq结果

*为染色体核型低比例嵌合病例

表2 致病性染色体微缺失结果

2.4 随访结果对所有高龄孕妇进行产后电话随访，11例致病性染色体异常患者已进行引产；2例染色体非整倍体异常孕妇已足月分娩，其中1例为47,XXX，足月分娩，尚未见明显异常，1例为47,XN,+21，足月分娩(孕妇强烈要求保留胎儿)，胎儿出生后已出现心脏异常；1例疑似致病染色体16p11.1p11.2微缺失，已足月分娩，未见明显异常；2例低比例嵌合，足月分娩，未见明显异常。

3 讨论

CNV-Seq是一项基于高通量测序技术的基因组拷贝数变异检测，可通过测序深度的调整，改变分辨率，检测不同大小的CNV，本研究中所用的方法分辨率为100 kb，该方法可很好的弥补核型分析分辨率低的不足。CNV-Seq的优势主要有检测范围广、高通量、周期短、分辨率高、操作简便、低DNA样本量[1]，并且已有很多研究者对该方法的适用性进行评估，Wang et al[2]报道该技术相较于核型分析对致病性或可能致病性的检出率由1.8%提高至2.8%，有很好的可靠性和准确性。本研究对80例高龄孕妇的羊水样本同时进行了CNV-Seq和核型分析，致病性异常14例，检出率为17.5%，致病性染色体非整倍体异常11例，包括21三体6例，18三体3例，性染色体非整倍体异常2例，致病性染色体微缺失3例(明确致病的染色体微缺失2例，可能致病的染色体微缺失1例)。CNV-Seq和核型分析均检测出致病性染色体非整倍体异常，但3例致病性染色体微缺失，均未在核型分析时被检测到。该结果表明对高龄孕妇实施产前诊断非常必要，并且应用CNV-Seq能明显增加致病性染色体微缺失、微重复的检出率。染色体微缺失、微重复会导致一些复杂临床表型(如生长发育异常、智力发育迟缓、内脏器官畸形、内分泌异常等)的综合征发生，是染色体疾病中的常见类型，目前已发现67余种染色体微缺失、微重复综合征，发病率约在1/4 000～1/50 000[3]。通过本研究证实CNV-Seq是检测该种染色体畸变的有效方法，因此对高龄孕妇的产前诊断联合应用核型分析和CNV-Seq有很重要的临床意义。

对3例核型分析未检测到的致病性染色体微缺失结果分析如下：① 致病性染色体微缺失病例1：Y染色体长臂部分(24,026,787～26,227,153)片段缺失一个拷贝，长约2.20 Mb，为已知致病突变。该区域包含于“Spermatogenic failure, Y-linked”报道区域内，并且覆盖该病相关的“AZFc region”的主要基因BPY2、DAZ、CDY1等，Y染色体AZFc区域缺失是导致男性生精障碍最常见的原因。"Spermatogenic failure, Y-linked”的主要临床特征为无精症、轻度至严重少精症，从而导致男性不育。个体间临床表征具有差异性。阿周存 等[4]2006年报道，对128例严重寡精症患者和287个正常生精男性的DAZ基因缺失进行研究，发现DAZ1/DAZ2/DAZ3/DAZ4缺失仅见于严重寡精症患者，频率为11.7%；DAZ1/DAZ2缺失的频率在严重寡精症患者中显著高于正常男性(9.4%vs2.8%,P=0.004)；这些结果提示DAZ基因全部拷贝缺失是严重寡精症患者生精障碍的常见遗传病因，而DAZ1/DAZ2缺失则可能是一种高风险因素。该孕妇已进行引产。② 致病性染色体微缺失病例2：X染色体短臂部分(6,427,993～8,147,809)片段缺失一个拷贝，长约1.72 Mb，为已知致病变异。该区域包含OMIM收录的致病基因STS，STS基因功能异常关联疾病“Ichthyosis, X-linked”。多篇文献[5-7]报道，在X-linked ichthyosis患者中检出STS基因部分或全基因缺失突变。“Ichthyosis, X-linked”的临床表现包括：眼角膜混浊，视力通常不受影响；鱼鳞病，皮损通常对称发生，主要发生在四肢、头皮、颈部和躯干上，呈棕色；男性隐睾，睾丸癌风险增加；产前表现为晚产；出生后1年内发病，大部分(80%～90%)由STS基因缺失导致，男性发病率为1 ∶6 000[8-9]。该病呈X连锁隐性遗传，本送检样本检出STS基因缺失一个拷贝，由于该孕妇胎儿为男性，则会导致疾病的发生。该孕妇已进行引产。③ 可能致病性染色体微缺失病例3：16号染色体短臂部分(34,214,421～35,180,066)片段缺失一个拷贝，长约965.64 kb，为疑似致病变异。据Molck et al[10]报道，在1例表型为动脉闭锁、室间隔缺损和肺动脉闭锁缺陷的患者中检出了16p11.1p11.2区域的缺失变异，长约961 kb，该区域包含基因UBE2MP1、LOC146481、LOC100130700、RN5S411和FLJ26245。本次检出变异与文献报道变异相近，为疑似致病变异。电话随访，该孕妇足月分娩，目前未发现明显异常，将继续对其随访了解其远期预后。

本研究中有2例核型分析检出的10%以下低比例嵌合异常未能通过CNV-Seq检测到，此案例一方面反映了CNV-Seq的不足，但另一方面也能在未实施其他方法复查的情况下通过CNV-Seq印证该羊水细胞嵌合比例低于10%。临床建议这2例孕妇去其他医院通过FISH复查，但孕妇拒绝。羊水培养中很容易出现假性嵌合，羊水中假性嵌合体大多为两条染色体的易位、一条染色体的丢失、标记染色体、一条染色体的增加和染色体部分三体等，大部分妊娠结局良好[11]。该两例嵌合，1例为46,XN,t(11;15)[6]/46,XN[56]，另1例为47,XN,+2[10]/46,XN[120]，嵌合比例较低，并且比较符合羊水假性嵌合体，在孕妇未通过其他方法验证的情况下，B超监测并随访，该2例孕妇均已足月分娩，未发现异常。

通过此项研究发现高龄与染色体异常密切相关，并且该染色体异常不仅包括非整倍体染色体异常，也包括染色体的微缺失和微重复。因此在对高龄孕妇实施产前诊断时，联合核型分析和CNV-Seq检测将有效提高致病性检出率，降低出生缺陷，为临床的产前咨询提供有效可靠的依据。