朱贝 韩双印 杨亚莉

【摘 要】目的：观察由靶向黏蛋白1（Mucl protein 1，MUC1）嵌合抗原受体修饰的NK细胞（Chimeric antigen receptor-Natural killer cell，CAR-NK）对裸鼠胃癌模型肿瘤生长的影响。方法：首先，在48只裸鼠右肢腋下注入0.2ml浓度为105个/ml的人胃癌细胞（MGC-803）构建胃癌肿瘤模型。当小鼠肿瘤体积生长至约100mm3时，将小鼠随机分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组和实验5组。其中，对照组给予未修饰的浓度为1×105个/ml 的NK细胞;实验1-5组给予相同体积靶向MUC1的CAR-NK细胞，细胞浓度分别为1×105、1×106、1×107、1×108、1×109/ml。给药后，每隔3d统计肿瘤的长短径以及小鼠体重。自接种MGC-803 26d后，脱颈处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量并计算其生长率。结果：与对照组比，各实验组瘤重明显减轻，瘤体积明显减少（P<0.05），但各实验组之间比较，无统计学差异（P>0.05）。与对照组比，各实验组小鼠的生长率明显增加（P<0.05），且实验1、2、3组显著高于实验4、5组（P<0.05）。此外，各组小鼠的肿瘤体积均随小鼠生长时间的延长呈逐渐增加趋势。且从第8d给予CAR-NK细胞治疗后，其余各实验组在相同给药时间点与对照组相比，均有统计学差异（P<0.05）。结论：裸鼠皮下移植肿瘤模型显示，靶向MUC1的 CAR-NK细胞对表达MUC1的MGC-803细胞生长具有较好的抑制作用，且所用浓度范围较广，安全系数较高。

【关键词】黏蛋白1;嵌合抗原受体NK细胞;胃癌;裸鼠模型

【中图分类号】R573 【文献标识码】A 【文章编号】1004-597X（2019）19-0031-02

胃癌是发病率较高的恶性肿瘤，由于前期症状不明显，易与其他慢性病混淆，多数患者至疾病晚期才得到诊断[1-2]。手术、放疗和化疗是目前胃癌治疗的主要方法，尽管能起到一定效果，但仍未明显改善患者预后[3]。基于嵌合抗原受体修饰T细胞或NK细胞是近年快速发展的免疫治疗新技术，在血液肿瘤中已取得良好的抗肿瘤作用。然而，在实体瘤中仍面临很大挑战。MUC1是在多种肿瘤表面表达的肿瘤相关抗原，靶向MUC1的各种免疫治疗策略已在实验室和临床试验中展开[4]。本研究制备靶向MUC1的CAR-NK细胞，观察其对MGC-803裸鼠模型的抑瘤作用，为胃癌的细胞免疫治疗探索新方法。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：6～8周龄，体重为20±2g的SPF级成年雄性BALB/c（nu）小鼠48只，均购自凯学生物科技（上海）有限公司。

1.1.2 主要实验细胞：人胃癌MGC-803和靶向MUCI的CAR-NK细胞均由本实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 MGC-803培养：将人胃癌细胞株MGC-803常规培养、传代，取对数生长期细胞，PBS 洗涤3次，台盼蓝染色法检测其细胞活力，调细胞浓度为1×105/ml。

1.2.2 靶向MUC1的 CAR-NK细胞培养：取出冻存细胞，置于37℃恒温水浴中快速融化，于超净工作台内将细胞悬液吸出置于15ml离心管中，加入10ml RPMI l640培养基1000rpm/min离心5min洗涤，加入新鲜培养基重悬，置于含10%胎牛血清和100U/ml双抗的RPMI l640培养基中扩增培养。

1.3 胃癌小鼠模型的建立

1.3.1 将6周龄BALB/c裸鼠先置于SPF级环境中饲养3d后，称量小鼠初始体重。

1.3.2 小鼠状态适应后将对数生长期的MGC-803制备成浓度为1×105/ml单细胞悬液，吸取0.2ml 接种于BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下[5]。

1.3.3 接种后每天观察小鼠状态以及成瘤状况，约第5d可摸到右肢下结节，当结节长径大于5mm时，表示模型构建成功。在肿瘤长到第8d时，用游标卡尺测量小鼠右肢下结节的长短径，并称量每只小鼠体重。

1.4实验治疗方法

当小鼠肿瘤体积生长至约100mm3（约接種MGC-803的第8d）时，对照组尾静脉给予0.2ml浓度为1×105/ml的正常NK细胞溶液;实验1-5组分别尾静脉给予0.2ml浓度为1×105、1×106、1×107、1× 108、1×109 CAR-NK/ml的靶向MUC1的CAR-NK细胞，且每隔3d尾静脉给药一次，共给药6次。同时每隔3d用游标卡尺测量肿瘤长径（A）和垂直横径（B），按公式V=A×B2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积增长曲线，同时称量小鼠体重并绘制体重生长曲线。免疫治疗结束后第3d，对小鼠的体重、瘤重以及剥瘤后体重进行称量。

1.5 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验和One-Way ANOVA方差分析。P<0.05为有统计学差异。

2.结果

2.1免疫治疗对小鼠行为学等特征的影响

模型建立前每只小鼠行为表现相似，正常饮水和进食。但自移植瘤模型成功建立后，对照组小鼠开始表现出活动量减少，精神状态差和食欲下降的症状，且在实验进行第16d时基本不进食;而接受CAR-NK细胞免疫注射治疗后的各实验组小鼠，精神状态都较对照组活泼，且食欲下降不太明显。

2.2 免疫治疗对各组小鼠瘤重和瘤体积的影响

与对照组相比，各实验组瘤重明显减轻，瘤体积显著减少，有统计学差异（P<0.05）;但各实验组之间相比，无统计学差异（P>0.05），详见表1。

2.3 免疫治疗对各组小鼠生长率的影响

与对照组相比，各实验组小鼠生长率明显增高，有统计学差异（P<0.05）;且实验1、2、3组小鼠的生长率显著高于实验4和5组，有统计学差异（P<0.05），详见表2。

2.4 免疫治疗对小鼠肿瘤体积的影响

结果显示，各组小鼠的肿瘤体积均随小鼠生长时间的延长呈逐渐增加趋势（图1）。其中，对照组小鼠的肿瘤体积随生长时间持续增加，且增长速度较快;而各实验组则随小鼠的生长时间表现为较平缓增长。此外，从第8d给予CAR-NK细胞治疗后，其余各实验组在相同给药时间点与对照组相比，均有统计学差异（P<0.05），详见图1。

2.5 免疫治疗对各组小鼠体重的影响

在第8d给药后，实验1、2、3组小鼠体重出现短期快速增长，之后增长平缓;实验4、5组小鼠体重一直保持较慢增长，且在第23d后体重出现轻微的下降;而对照组小鼠体重表现出持续下降趋势，且随时间延长下降速度逐渐增快，详见图2。

3.讨论 

MUC是一类高分子量糖蛋白，主要特征为含有一个高度糖基化的串联重复区，是目前研究较为深入的黏蛋白，属跨膜蛋白[6-7]。人MUC1基因定位于1q21.24 位点上，MUC1 蛋白由多肽骨架和O-糖苷键链接的糖基侧链组成，多肽骨架由胞内段、跨膜段、胞外段三个部分构成。其中胞内段可介导细胞信号转导，且胞内段和跨膜段在不同种属之间的结构高度保守;胞外段决定MUC1 空间结构特异性和免疫原性[8-9]。通常情况下，由上皮细胞产生的MUC1 可在黏膜表面形成胶样凝胶，发挥润滑、保护黏膜以及屏障作用。当细胞癌变时，MUC1结构与功能也随之变化，直接参与肠癌、膀胱癌等的发生发展[10-11]。MUC1在癌细胞中的表达量明显增加，呈非极性，同时MUC1糖链的糖基化异常，糖链变短且分支减少，可引起新糖链表位形成及肽链表位暴露，使MUC1成为能被免疫系统识别的肿瘤抗原。有学者认为MUC1作为一种肿瘤免疫抗原，在对其进行靶向效应时，或可对肿瘤的进展产生一定影响。

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程。随着人们对肿瘤研究的不断深入，MUC1在胃癌表达和转移中的作用也日益凸显[12]。有研究表明，MUC1粘蛋白的表达增加与胃癌的预后较差显著相关[13]。Grohmann等[14]对128例胃癌标本的研究显示，MUC1在管状腺癌中的表达比印戒细胞癌、硬癌或未分化癌中强;在肠型胃癌中的表达比在弥漫性胃癌中强，且在I期患者中的表达与预后呈负相关。因此，可通过检测MUCl的表达来确定胃癌的恶性程度及预后判定。综上所述，本文主要针对MUC1免疫抗原构建靶向MUC1的CAR-NK细胞对胃癌肿瘤模型进行免疫治疗。

本研究发现：与对照组相比，各实验组瘤重明显减轻，瘤体积明显减少说明靶向MUC1的 CAR-NK细胞有抑制肿瘤增长的作用;与对照组相比，实验组小鼠的生长率明显增加，且实验1、2、3组的生长率显著高于实验4、5组，提示1、2、3组靶向MUC1的CAR-NK细胞浓度抑制胃瘤小鼠效果较为理想。国内外已有研究报道，采用MUC1-2 VNTR基因治疗后可明显减小肿瘤体积及质量[15-16]，与本研究结果相一致。此外，本研究显示，各实验组小鼠的瘤体积随小鼠生长时间延长而缓慢增加，而对照组小鼠的瘤体积随小鼠生长时间延长呈快速增长趋势。但在小鼠体重方面，第8d给药后，实验1、2、3组小鼠体重出现了短期快速增长，之后增长平缓;实验4、5组小鼠体重一直保持较慢增长直至23d后出现轻微的体重下滑;而对照组小鼠体重表现出持续下滑的趋势，提示1×105、1×106、1×107 CAR-NK/ml浓度的靶向 MUC1 的CAR-NK细胞对小鼠体重影响较大。从上可知，靶向MUC1的CAR-NK细胞对小鼠胃癌肿瘤模型具有较好的治疗作用。

综上所述，靶向MUCI的CAR-NK细胞对于表达MUC1的MGC-803所形成的实体瘤生长具有较好的抑制效果，且所用浓度范围较广，安全系数较高，可减轻疾病所带来的痛楚，为后续深入研究抑制胃癌肿瘤的作用机理奠定了坚实的基础。

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作者简介：朱贝（1989—），女，汉，河南新乡人;单位：新乡医学院，硕士研究生，研究方向：肿瘤免疫治疗的临床和基础研究.

通讯作者：韩双印;单位：河南省人民医院;博士研究生导师，研究方向：肿瘤免疫治疗的临床和基础研究.