(长江大学医学部， 湖北 荆州 434023) (暨南大学附属第一医院， 广东 广州 510630)

众所周知，皮肤伤后如果不能及时修复将会发生感染等问题，使伤口愈合更加困难，因此选择具有促进伤口早期愈合的药品或敷料是伤口治疗和护理的关键。蜂蜜作为伤口敷料应用于临床以来，其功效显而易见。据文献[1～4]报道，在国内外蜂蜜治疗伤口的临床研究中，所涉及的伤口呈多样性，如感染性伤口、烧伤、混合性伤口、溃疡、外伤、手术伤口、恶性伤口等，而且这些研究结果显示蜂蜜可以有效治疗伤口。由此可见，蜂蜜治疗伤口的疗效在临床上已经被验证。在医药资源不丰富地区或者在环境条件受到限制的情况下，使用蜂蜜治疗伤口不失为一种很好的选择。然而，蜂蜜是如何促进伤口愈合的机理至今仍然不清楚，使蜂蜜的应用受到局限。笔者以大鼠作为研究对象，在其背部皮肤建立伤口模型，用蜂蜜涂抹，并通过观察蜂蜜在皮肤组织修复中炎性细胞浸润、毛细血管再生、纤维组织形成等组织学指标的变化，揭示蜂蜜促进皮肤修复的演变过程和作用，从组织细胞学水平探讨蜂蜜对创伤皮肤的修复机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验用健康SPF级Wistar大鼠32只，由取得动物实验资质的动物实验中心提供，雌雄各半，28d左右，体重约(95.0±4.0)g。荞麦蜜(陕西老蜂农蜂业有限公司)，皮肤取样器(海德创业北京生物科技有限公司)，光学显微镜(上海光学仪器一厂)，无水乙醚(荆州市杰胜药业有限公司)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1)建模方法。将大鼠用乙醚气体吸入麻醉，剪去大鼠背部皮肤毛发2cm×2cm，两指绷紧大鼠背部皮肤，用皮肤取样器在剃毛区剃去皮肤，形成一个直径为0.6cm的圆形创面，深度达筋膜，所有大鼠均在背部的相同位置建模。

2)分组方法。将32只建模大鼠随机分为2组，即蜂蜜组和对照组，各16只。蜂蜜组：每天涂抹蜂蜜3次，每次涂抹蜂蜜0.5mL，每次涂抹蜂蜜后更换无菌敷料；对照组：不涂药，仅用无菌纱布遮蔽，每次给蜂蜜组涂药更换敷料的同时也为其更换纱布，使其自然愈合。

3)标本收集和处理。建模之后(不含当天)的第1、3、5、7天，4d中每天每组随机取4只大鼠切除包括伤口周围1cm内的正常皮肤直至筋膜，将其用组织固定液固定、常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、连续切片(厚度为4μm)，并将切片脱蜡至水化，最后行HE染色。

4)观察方法与指标。创面修复的观察是通过光镜完成，主要观察指标为炎症细胞浸润、毛细血管再生和纤维组织增生等3项。评分标准：①无炎性细胞浸润记0分，稀疏散在的浸润记1分，密集的浸润记2分，高度密集的浸润记3分；②无新生毛细血管记0分，少量新生血管记1分，中量新生血管或者血管中含少许血细胞记2分，大量新生血管或者血管中含较多的血细胞记3分；③无成纤维细胞记0分，散在分布的成纤维细胞记1分，密集分布的成纤维细胞记2分，高度密集分布的成纤维细胞记3分。每只大鼠随机选3张皮肤组织切片，每张切片取10个不重叠视野，分别在长轴中线4个和上下边线各3个，共计4只鼠、3张片、10个视野，共计120个观察点，进行观察并记分。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 炎性细胞浸润

表1 2组不同时间点炎性细胞浸润的积分比较

伤后第1天2组均出现不同程度的炎性细胞浸润，细胞间质疏松水肿，尤其是蜂蜜组较对照组更为明显，大多数观察点有大量密集的炎性细胞浸润，2组得分有统计学差异(P<0.05)；第3天蜂蜜组浸润较第1天明显减少，而对照组反而加重，可见大量中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞聚集成团，2组得分有统计学差异(P<0.05)；第5天蜂蜜组少数观察点有少许炎性细胞，对照组浸润与第3天比较减少并不显著，2组得分有统计学差异(P<0.05)；第7天蜂蜜组未见炎性细胞，对照组浸润与第5天有下降，但仍然清晰可见，2组得分有统计学差异(P<0.05)，见表1。对照组第1、3、5、7天炎性细胞浸润如图1所示；蜂蜜组第1、3、5、7天炎性细胞浸润如图2所示。

2.2 毛细血管增生

第1天2组均未见新生毛细血管；第3天蜂蜜组出现中等量新生毛细血管，对照组有少量的新生毛细血管，2组比较有显著差异(P<0.05)；第5天蜂蜜组毛细血管增生更加明显，大量新生毛细血管呈扩张状态，内含血液。对照组毛细血管增生与第3天比较不明显，2组有统计学差异(P<0.05)；第7天蜂蜜组新生毛细血管的程度较第5天明显下降，大部分观察点只有少量新生毛细血管。相反对照组毛细血管增生继续保持升高态势，2组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。对照组第1、3、5、7天毛细血管增生如图1所示；蜂蜜组第1、3、5、7天毛细血管增生如图2所示。

图1 对照组炎性细胞浸润、毛细血管增生和纤维增生(HE,×20) 图2 蜂蜜组炎性细胞浸润、毛细血管增生和纤维增生(HE,×20)

组别毛细血管增生积分/分第1天第3天第5天第7天对照组01.08±0.6681.58±0.7932.42±0.516蜂蜜组01.75±0.4522.66±0.6510.83±0.717t-3.3934.6618.227P-0.0060.0000.000

表3 2组不同时间点纤维增生的积分比较

2.3 纤维增生

2组第1天均未见成纤维细胞；第3天蜂蜜组可见中等量梭形成纤维细胞，对照组有少量成纤维细胞，2组有统计学差异(P<0.05)；第5天蜂蜜组有大量密集的成纤维细胞，排列规则，呈束状分布。对照组成纤维细胞较第3天有少量增加，但未达到中等量，2组差异有统计学意义(P<0.05)；第7天蜂蜜组成纤维细胞数量很少见，较第5天显著减少，间质明显增多。对照组成纤维细胞继续明显增加，2组有统计学差异(P<0.05)，见表3。对照组第1、3、5、7天纤维增生如图1所示；蜂蜜组第1、3、5、7天纤维增生如图2所示。

3 讨论

3.1 皮肤组织修复机制

创伤愈合是皮肤组织修复的过程，当皮肤受伤时，皮肤组织即刻发生包括炎性反应、以血管内皮细胞和成纤维细胞为主的各种细胞再生、肉芽组织填充和瘢痕形成等在内的一系列复杂的组合变化，表现出各种修复的协同作用。由于皮肤是由表皮、真皮、皮下组织等部分构成，因此受伤的深度不同其修复的机理也不一样[5]。笔者给大鼠皮肤造模的创伤深度达筋膜，属于全层皮肤伤。根据皮肤全层受伤的组织修复机制分析：当大鼠皮肤创伤造模成功时，首先出现局部的炎症反应，表现为毛细血管通透性增加，各种炎症细胞向创伤处聚集，如单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等[6]，它们不仅具有强大的吞噬能力，吞噬创伤局部的细菌和异物颗粒，达到清理局部和抗菌的目的[7]；还可以相互作用和转化，来调控伤口愈合[8]。紧接着邻近创面的血管其内皮细胞通过分裂增生向无血管或者少血管区迁移，逐渐形成毛细血管芽，这些毛细血管芽再通过延伸融合成网，进而管道化且有血液进入。在不给予干预的情况下大约在伤后第3天即可见毛细血管芽从伤口边缘长出[9]。在新生毛细血管生长的同时，邻近的成纤维细胞也同时增生，与新生毛细血管共同构成肉芽组织，向创面移行填塞伤口，并转化为肌成纤维细胞，不断分裂、增殖，分泌胶原，形成纤维组织。同时成纤维细胞还可分泌成纤维细胞生长因子，促进创缘表皮细胞增生，逐渐覆盖伤口[10]，使伤口愈合。在此期间，倘若炎性细胞的吞噬能力不足以清除细菌创面就会继发感染；倘若肉芽组织增生过度还会形成病理性瘢痕。据文献报道，创面愈合时间越长，产生病理性瘢痕的机率则越大[11]。因此及早使创面愈合既可以减少继发感染的机会，也可以有效减少增生性瘢痕产生的可能性。显然以上创面愈合的自然过程，需要有良好的环境条件做保障。可见营造良好的伤口愈合环境、缩短伤口愈合时间、阻止肉芽组织过度增生是促进伤口安全愈合的关键。

3.2 蜂蜜在创面愈合中的作用

蜂蜜有其特殊的理化性质，可以为伤口愈合提供良好条件。首先它含有70%～80%的糖分[12]，能营造一种高渗环境，这种高渗环境不仅可以吸收深层体液来保持创面湿润、吸收炎性细胞内水分来消除创面水肿，从而保护创面；还可以使细菌脱水死亡，达到抑制细菌生长的目的[13]，这也是为什么有文献报道[1]蜂蜜对感染性伤口具有良好疗效的原因。其次，蜂蜜中还含有丰富的营养物质，如葡萄糖、转化糖、转化酶及多种维生素、微量元素、氨基酸等[14]，这些营养物质一旦被组织细胞利用，则有利于加速创面愈合。

研究结果显示，对照组因为没有给予干预措施，其创伤愈合过程符合上述的伤口自然愈合规律；而蜂蜜组则可以加速伤口愈合，防止瘢痕形成。

从炎性浸润看，对照组呈现出第1天大量浸润、第3天浸润更加严重、第5天持续高水平状态、第7天才逐渐下降的变化过程。而蜂蜜组在伤后第1天炎性细胞浸润即达顶峰，之后保持迅速下降趋势，第7天炎性细胞完全消失。这充分说明蜂蜜在皮肤受伤早期可以促进皮肤组织炎性细胞的快速分泌，从而加强清理局部异物和抵抗细菌的功效，预防创面继发感染；中期则可抑制炎性细胞分泌，是具有促炎和抗炎双重作用的物质。蜂蜜之所以具有双重作用是因为：蜂蜜中不仅含有丰富的营养物质，还含有大量的生物活性物质，如黄酮类、酚酸类、有机酸、芳香物质等[15]，这些生物活性物质具有免疫调节作用，在皮肤受伤早期可以通过增强细胞内线粒体的活性来活化巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞[16]，使其快速增殖，大量分泌；在创伤愈合的中期通过抑制机体多种免疫刺激性细胞因子的释放[17]，使炎性细胞的增殖得到控制，从而抑制皮肤组织的炎性反应。不仅如此，蜂蜜还可以通过营造一种高渗环境，消除创面的炎性水肿，促进炎症消散，为创面早期愈合奠定基础。鉴于上述分析，笔者认为蜂蜜的这种抵抗细菌的较强能力和抑制炎性反应的强大作用很可能就是它促进伤口愈合的重要原因之一。

从新生毛细血管和纤维组织增生看，对照组在伤后的第3天开始有少量的新生毛细血管和成纤维细胞出现，之后逐渐增加，直至第7天还大量存在，仍然保持高水平状态，这就给肉芽组织的继续形成创造了条件。由于此时正处于创伤愈合后期，如果肉芽组织继续不断形成，产生瘢痕的可能性则增大。产生这一结果的原因可能有2个：一是此时伤口还没有完全愈合，仍然需要肉芽组织去继续填充；二是此时创伤局部的炎性细胞水平仍然较高，这些炎性细胞可以产生大量的生物活性因子，如转化生长因子、成纤维生长因子、血小板源生长因子等[16]，而这些生物活性因子可以促进毛细血管再生和成纤维细胞形成[18]，致使新生毛细血管和纤维组织水平不会降低。蜂蜜组在伤后的第3天不仅可以见到新生的毛细血管和成纤维细胞，而且其增生异常活跃，增生的速度和量远超对照组。这种高水平的增生维持到第5天达到高峰，然后快速下降，第7天仅剩少量新生毛细血管和成纤维细胞。这充分说明蜂蜜在创面愈合的中期可以加速毛细血管和纤维组织增生，致使毛细血管和纤维增生的峰值提前，加快创面愈合；在创面愈合的后期蜂蜜能迅速限制毛细血管和纤维组织增生，阻止其增生过度而形成病理性瘢痕。分析其原因，这可能与蜂蜜具有免疫调节作用有关。据文献报道，在创伤早期蜂蜜能够介导成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板源生长因子和肿瘤坏死因子等各种因子的释放[19]，这些生长因子和细胞因子可以刺激血管内皮细胞和成纤维细胞快速生长[20]，从而促进血管新生和纤维组织增生。也正是因为蜂蜜可以使创面局部的毛细血管增生活跃，创面微循环丰富，蜂蜜中丰富的营养物质就很容易被组织细胞获取，为毛细血管和纤维组织的生长提供营养，进一步加速毛细血管和纤维组织的生长，因此蜂蜜组与对照组比较，毛细血管和纤维组织生长峰值明显提前，创面愈合的速度加快。笔者认为这也是蜂蜜能促进创面修复的重要原因。在创伤修复的后期，蜂蜜可以刺激机体产生较多的某种具有停止信号功能的物质，从而减小毛细血管再生和纤维组织增生的作用[17]，使毛细血管和纤维组织的增生减少甚至停止。当然这一推理还需要做更多的研究给予验证。由此可见，蜂蜜一方面是通过促进皮肤创面早期愈合来预防瘢痕的形成，另一方面是通过限制毛细血管和纤维组织的增生达到预防瘢痕形成的目的。

综上所述，蜂蜜在皮肤组织修复中对炎性浸润、毛细血管再生、纤维组织增生的影响具有双重性。在皮肤修复的早期(1～2d)，蜂蜜可以促进炎性细胞的大量分泌，既可以提高局部的抗菌能力，避免创面继发感染，又可以充分发挥炎性细胞的调节作用；在皮肤修复的中期(3～5d)，蜂蜜具有抗炎性细胞分泌，促进炎症消散，为创面愈合营造良好环境的作用，具有促进毛细血管再生和纤维组织增生，加速肉芽组织形成，加快创面愈合的作用；在皮肤修复的后期(6～7d)，蜂蜜可以抑制毛细血管再生和纤维组织增生，阻止肉芽组织生长，预防瘢痕形成。笔者研究只是从组织细胞学水平探讨了蜂蜜在皮肤修复中的作用，仍然还需要进一步从分子学角度探讨蜂蜜在皮肤组织修复中的调控机制。