黄秒 董国庆 肖菲 张纪泳 苏月月 李明珠

南方医科大学附属深圳妇幼保健院儿科（广东深圳518028）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种由炎症风暴导致涉及全身非特异性中小血管炎，病因及发病机制尚不明确，推测可能受感染、遗传、环境、免疫及炎症等多种因素有关，未经治疗患儿其中有20%～25%合并冠状动脉损害（coronary artery lesion，CAL）［1］。研究［2］证实，抵抗素（resistin，RETN）参与炎症反应，促进冠心病的发生、发展。有文献［3］报道抵抗素基因启动子-420位点C/G多态性影响血清抵抗素水平。至今，已经发现数个抵抗素基因中的单核苷酸多态性位点，其中研究得最多的是RETN启动子-420C＞G（rs l862513）位点，且RETN-420C＞G多态性与冠状动脉疾病、炎症反应等密切相关［4］。目前有关川崎病与抵抗素基因多态性文章研究较少，且结论不一。有研究表明抵抗素基因-420C/G（rs1862513）位点多态性与川崎病有关［5］。为探讨抵抗素基因-420C/G位点多态性与川崎病的关系，本文选取81例川崎病患儿和100例健康儿童作为研究对象，分析抵抗素基因-420C/G位点多态性及其血清抵抗素水平，为预防和控制川崎病及其冠脉损伤提供理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象选2014年1月至2016年12月深圳市妇幼保健院住院KD患儿81例作为KD组；KD诊断和冠状动脉损伤诊断参考《实用儿科学（第7版）》的诊断标准［6］。KD组年龄3个月至6岁，平均（1.8±1.5）岁，男49例，女32例。根据是否合并冠状动脉损伤，分为CAL组，11例均为轻度冠状动脉扩张，年龄8个月至6岁，平均（2.3±1.7）岁，男8例，女3例；冠状动脉正常组（NCAL组）70例，年龄3个月至6岁，平均（1.7±1.4）岁，男47例，女23例。另选同时间段在我院体检的健康儿童100例作为正常对照组，均排除既往疾史，经常规体格检查、肝功能、肾功能、尿常规等检查均无异常。对照组年龄4个月至6岁，平均（2.0±1.3）岁，男65例，女35例。KD组与正常对照组在年龄、性别比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。同时CAL组与NCAL组年龄和性别比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。KD组与正常对照组人群抵抗素-420均符合Hardy-Weinberg遗传定律（P＞0.05），表示本研究选取研究对象具有群体代表性。

1.2方法

1.2.1标本的采集与保存研究已获得深圳市妇幼保健院伦理委员会的批准，取得所有研究对象及监护人知情同意，取外周静脉血4 mL，取2 mL用全血基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司，编号SK8224）提取总DNA；然后紫外分光光度仪测定DNA纯度和含量，A260/A280在1.7～2.0之间，并计算产物浓度。将DNA保存-80℃超低温冰箱备用。剩余2 mL置于含肝素锂的真空采血器中，分离血清，-80℃冰箱保存，集中时间统一采用ELISA法测定血清抵抗素。

1.2.2血清抵抗素水平测定所有研究对象用双抗体夹心ELISA法测定血清抵抗素水平，试剂盒由美国R&D公司提供。

1.2.3抵抗素基因-420C/G位点基因多态检测（1）引物设计与PCR扩增。采用Premier 5.0设计引物，并委托上海生工合成。人抵抗素基因-420位点体外扩增的引物如下：正向引物：5′-TGGCTTGGCTAATAAGTCCCT-3′，反向引物：5′-GTTGCCCAGACTGGAGTGC-3′，片段大小 395 bp。PCR反应体系（25 μL）如下：样本DNA 为1 μL，正反向引物各为0.5 μL，dNTP 10 mmol/L 取0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq酶5 U/μL 0.2 μL，水为20 μL。PCR的反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30～60 s，总共35个循环；72℃终末延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，确定为目的产物。（2）基因分型。取PCR产物20 μL由上海生工测序。测序的步骤如下：①制备样本（过膜或切胶）；②用双脱氧链终止法PCR扩增；③3730xl DNA Analyzer测序仪进行测序，并输出结果。（3）PCR产物测序的结果。用PCR产物纯化回收试剂盒（生工，编号B518131），通过 NCBI数据库查询rs1862513（人抵抗素基因SNP-420C/G）基因序列CAGGGCCTCCVTCTTCATGTC，测序结果出现3种基因型CC、CG和GG，见图1。

图1 rs1862513（人抵抗素基因SNP-420C/G）基因序列CAGGGCCTCCVTCTTCATGTCFig.1 rs1862513（Human RETN gene SNP-420C/G）gene sequence CAGGGCCTCCVTCTTCATGTC

1.3统计学方法通过SPSS 16.0软件进行统计学分析。将符合正态分布计量资料用均数±标准差表示，两组间的比较用独立样本t检验方法，3组间的比较用单因素方差分析；基因型及等位基因频率采用R×C表χ2检验；对照组、病例组进行哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1KD患儿基因多态性分布情况81例KD患儿中抵抗素基因-420基因型CC型、CG型、GG型频率分别为18.5%（15/81）、44.4%（36/81）、37.1%（30/81）；100例正常儿童抵抗素基因-420基因频率分别为13%（13/100）、51%（51/100）、36%（36/100）。抵抗素基因-420位点CC、GC、GG基因型频率及C和G等位基因频率在KD组和正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 KD组与正常对照组抵抗素-420位点基因型及等位基因频率的比较Tab.1 Genotypes and allele frequencies of the resistin gene in Kawasaki disease（KD）patients and the controls 例（%）

2.2KD合并CAL组与NCAL组抵抗素-420位点基因型及等位基因频率的比较70例无CAL者中抵抗素基因-420基因型CC型、CG型、GG型频率分别为18.6%（13/70）、42.8%（30/70）、38.6%（27/70）；11例并CAL者抵抗素基因-420基因频率分别为18.2%（2/11）、54.5%（6/11）、27.3%（3/11）。KD组中并CAL者与NCAL者基因型分布频率和等位基因频率比较差异亦无统计学意义（χ2=0.621、0.234，P=0.838、0.628）。见表2。

2.3各组血清抵抗素水平比较KD组血清抵抗素水平（30.06±5.86）ng/mL较正常对照组（25.64±9.00）ng/mL明显升高，差异有统计学意义（t=3.725，P＜ 0.001），见图2A。合并CAL血清抵抗素水平与未合并CAL组比较［（31.27±3.82）ng/mLvs.（29.87±6.13）ng/mL］差异无统计学意义（t=0.730，P=0.467），见图2B。KD组抵抗素基因-420基因型CC、GG、CG血清抵抗素比较差异无统计学意义（F=1.785，P=0.175），见图2C。正常对照组抵抗素基因-420基因型CC、GG、CG血清抵抗素比较差异无统计学意义（F=0.544，P=0.582），见图2D。

表2 CAL组与NCAL组抵抗素-420位点基因型及等位基因频率的比较Tab.2 Genotypes and allele frequencies of the resistin gene in KD patients with CAL and without CAL 例（%）

图2 组间血清抵抗素比较Fig.2 Comparison of serum resistin levels between different groups

3 讨论

研究发现一些基因单核苷酸的多态性与川崎病发生及其并发冠状动脉病变有关［7］。抵抗素基因是编码人类抵抗素蛋白，位于19p13.3，包括4个外显子和3个内含子。研究［8］发现，抵抗素基因多态性420C/G可能与心血管事件发病密切相关。MITANI等［9］研究表明，幼年时患有川崎病患儿合并轻度冠脉损伤成年后患缺血性心脏病。因此，早期筛选冠心病高危人群，提早预防，具有重大意义。本研究川崎病患儿抵抗素-420基因多态性与正常儿童比较，发现抵抗素-420基因多态性在两组人群中并无差异，提示抵抗素基因-420C/G位点与川崎病发生无关。同时分析合并冠脉损伤川崎病患儿与未合并冠脉损伤比较，抵抗素-420基因多态性亦无差异，提示抵抗素基因-420C/G位点与川崎病冠脉损伤发生不相关。目前对于抵抗素基因多态性在川崎病的研究不多，但结论不一。LIU等认为川崎病患儿抵抗素基因-420多态性与冠脉损伤不相关，与本研究一致。但也有研究［3］认为，抵抗素基因-420多态性在川崎病患儿中分布有差异。因本研究中川崎病合并冠脉损伤均为轻度冠脉扩张，且样本量偏少，具有一定的局限性，因此，抵抗素多态性与川崎病冠脉损伤有无关系需进一步扩大样本量证实。

研究证实，抵抗素基因-420多态性在日本人群与抵抗素血清学水平相关。在本研究中，正常健康儿童中抵抗素3种基因型血清抵抗素比较亦无差异，考虑可能与人群种族有关，需进一步大样本研究。同时，本研究KD组中三种基因型CC、CG、GG血清抵抗素比较无差异，提示在川崎病患儿中抵抗素-420多态性与血清抵抗素水平无相关。但本研究发现川崎病患儿中血清抵抗素较正常健康儿童明显增高，具有显著性差异，提示抵抗素水平变化可能与川崎病有关。有研究发现，抵抗素作为一种促炎因子，炎症时在人体内表现为高抵抗素状态。研究证实，抵抗素可通过激活炎症因子NF-κB途径增加血管细胞黏附分子等表达，从而使单核细胞和内皮细胞黏附，致内皮功能的紊乱，引起高抵抗素血症，导致血管的炎症［10］。本研究中发现川崎病患儿抵抗素水平明显增高可能与炎症有关。ZHANG等［11］证明脂肪因子与急性川崎病早期炎症密切相关，与本研究一致。同时本研究发现合并冠脉损伤川崎病患儿与未合并冠脉损伤抵抗素比较无差异，提示川崎病抵抗素水平与冠脉损伤不相关。

综上所述，KD患儿血清抵抗素与KD发生有关，尚未发现抵抗素基因-420C/G位点与川崎病及其CAL的发生存在明显关联性。因样本量偏小，本研究仍存在一定局限性，可进一步扩大样本并作深入探讨。