刘务玲， 姚尧， 陈娟， 吴昌学， 宋晶睿， 王春林， 邱剑飞，王立平， 朱伟明,3， 龙群**， 李艳梅**

(1.贵州省中国科学院 天然产物化学重点实验室， 贵州 贵阳 550014; 2.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550025; 3.中国海洋大学， 山东 青岛 266100)

白血病，又称血癌，是未成熟的血细胞异常过度增殖而导致的一种血液癌症，主要有急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性淋巴细胞白血病及慢性髓系白血病[1-2]。AML是白血病的一种，其特征是异常细胞在骨髓和血液中快速增殖，干扰正常血细胞功能。AML进展较为迅速，如果没有获得有效治疗，患者通常会在数周至数月内死亡。据统计,2015年全球约有白血病患者230万人，其中约100万人患有AML，美国癌症协会根据统计数据预测2018年在美国AML将是死亡案例最多的白血病。目前，临床上主要采用化疗方案治疗AML[4]，米哚妥林(midostaurin，PKC-412)是目前美国FDA唯一批准用于靶向麦克唐纳猫肉瘤(feline mcdonough sarcoma, FMS)样的酪氨酸激酶3 (Fms-like tyrosine kinase, FLT3)治疗AML的药物[5]，该药物在临床使用后会部分出现耐药，导致治疗效果不佳[6]。因此，开发更多治疗AML的新药尤为重要。HEL细胞是AML中红白血病的一种细胞系，可作为AML相关研究的典型细胞[7-10]，本研究选择HEL细胞作为研究对象，研究双吲哚马来酰亚胺衍生物化合物GZWM-051对HEL细胞的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人HEL细胞、人慢性髓系白血病K562细胞为实验室留存，双吲哚马来酰亚胺衍生物GZWM-051由中国海洋大学朱伟明教授课题组设计合成，纯度>95%。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Hoechst 33258、MTT试剂及二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司，蛋白裂解液及BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，PVDF膜购自美国Bio-Rad公司；Bcl-2、Casepase-3、Caspase-3剪切体(cleaved casepase-3)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)一抗购自美国Abcam公司，荧光标记抗兔二抗购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1细胞增殖活性采用MTT法，取对数期增长的HEL、K562细胞以8×103个/孔接种于一次性灭菌96孔板，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜，分别使用0.05、0.10及0.20 μmol/L GZWM-051，每个浓度设5个复孔，同时设阴性对照(等量DMSO)和阳性对照(0.2 μmol/L PKC-412)。在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24、48及72 h，分别加入5 000 mg/L的MTT试剂，然后37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养4 h，2 000 r/min离心20 min收集细胞，加入DMSO后置于摇床180 r/min动态处理20 min，490 nm波长下测定吸光度值(OD490值)；计算GZWM-051对细胞系的IC50及抑制率，绘制生长曲线。

1.2.2HEL细胞凋亡采用流式细胞术，取对数生长期HEL细胞以2×106个/孔接种于6孔板，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分别处理细胞，实验设阴性对照组(等量DMSO)；置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24及48 h，收集细胞，用1×PBS洗涤细胞， 2 000 r/min 离心5 min收集细胞；将细胞凋亡试剂用10×binding buffer稀释10倍，于细胞沉淀中加入稀释后的细胞凋亡试剂100 μL，彻底重悬细胞后转移至1.5 mL离心管；加入PI染液及Annexin V-FITC染液各5 μL，轻轻混匀，避光37 ℃处理15 min，立即上流式细胞仪检测。

1.2.3HEL细胞凋亡采用Hoechst 33258染色，取对数生长期HEL细胞以1×105个/孔接种于6孔板，以0.025、0.050 及0.100 μmol/L GZWM-051分别处理细胞，实验设阴性对照组(等量DMSO)。细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，用1×PBS洗涤细胞，离心收集细胞，用甲醇固定细胞10 min，再用1×PBS洗涤细胞，用Hoechst 33258处理细胞，室温避光染色10 min。去除染色液后用1×PBS洗涤2次，置于荧光显微镜上检测并分析。

1.2.4肿瘤细胞凋亡相关蛋白采用Western blot法，取对数生长期HEL细胞以4×105/孔接种于100 mm细胞培养皿中，细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分别处理细胞，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，实验设阴性对照组(等量DMSO)。培养24 h时，收集细胞，用预冷1×PBS洗涤细胞，离心收集细胞，加入含PMSF的蛋白裂解液，转移至1.5 mL离心管中。每隔5 min涡旋1次，冰上裂解30 min后置预冷离心机中12 000 r/min离心15 min。取上清液转移至新离心管中。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白样品浓度，用蛋白裂解液调平浓度，加入上样缓冲液，100 ℃加热煮沸5 min变性蛋白，置-80 ℃保存备用。用SDS-PAGE凝胶分离蛋白样品后转移至0.2 μm的PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后用抗体4 ℃孵育过夜，1×TBS洗膜，用荧光标记抗兔二抗室温孵育2 h，1×TBS洗膜，用双色红外荧光成像系统检测和分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 细胞增殖活性

MTT结果显示， GZWM-051能显著抑制HEL及K562细胞的增殖活性，GZWM-051处理HEL、K562细胞72 h时的IC50值分比为(0.06±0.01)及(1.45±0.28)μmol/L，均<2 μmol/L； GZWM-051以剂量依赖的方式显著抑制HEL细胞的增殖活性，且GZWM-051处理浓度为0.20 μmol/L时、对HEL细胞增殖活性的抑制能力强于阳性对照试剂PKC-412(图1)。

图1 不同浓度GZWM-051处理HEL细胞的生存曲线Fig.1 HEL cell proliferation in the presence of different concentrations of GZWM-051

2.2 细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，处理24及48 h时，各GZWM-051浓度组的HEL细胞凋亡率显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；48 h时的各GZWM-051浓度组HEL细胞凋亡率显著高于24 h各GZWM-051浓度组(图2)。Hoechst33258染色后，凋亡细胞的染色质皱缩而发生的高亮，且GZWM-051化合物对HEL细胞处理的浓度越高，细胞凋亡现象越明显(图3)。

2.3 细胞凋亡相关蛋白表达水平

Western blot结果显示，0.05、0.10 μmol/L GZWM-051组HEL细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平较阴性对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；各GZWM-051浓度组及阴性对照组细胞凋亡效应蛋白Casepase-3表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各GZWM-051浓度组Cleaved Casepase-3表达水平较阴性对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

3 讨论

2017年，米哚妥林(Midostaurin，PKC-412)被美国FDA批准用于临床靶向FLT3治疗AML[5]。而本研究结果显示化合物GZWM-051对HEL细胞的抗增殖活性强于PKC-412，并且GZWM-051对HEL细胞的IC50值仅为(0.06±0.01)μmol/L，提示微量的化合物GZWM-051即可显著抑制白血病细胞HEL的增殖。MTT法检测结果显示，化合物GZWM-051以剂量依赖方式明显抑制HEL细胞的增殖活性。不仅如此，化合物GZWM-051也对慢性髓系白血病细胞K562有着较好的抑制增殖活性，IC50值仅为(1.45±0.28)μmol/L，提示化合物GZWM-051具有重要的潜在临床应用前景。

1972年，科学家用电子显微镜研究组织时观测到与创伤性细胞死亡不同的细胞凋亡现象[11]。细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是发生在多细胞动物中高度调控和受控的过程，其特征是细胞形态改变、死亡。形态学变化包括气泡、细胞收缩、核碎裂、染色质凝结、染色体DNA碎裂和整体mRNA衰减。细胞凋亡可通过两种途径启动——线粒体途径(内源性途径)和死亡受体途径(外源性途径)，这两种途径都是通过激活Caspase导致细胞死亡[12-14]。Caspase是一类在细胞程序性死亡和炎症中起重要作用的蛋白酶，所有已知的Caspase都具有一个半胱氨酸活性位点，并在Asp-XXX键上(即天冬氨酸残基之后)裂解底物[15]。研究已发现Caspase酶有1 500多种底物，并且数量将会越来越多[16]。Caspase的激活确保细胞成分以可控的方式降解，在对周围组织影响最小的情况下导致细胞死亡[17]。Caspase-3是细胞凋亡过程中的一种终末剪切酶(凋亡效应蛋白)，在细胞凋亡过程中起关键作用[18-19]。需要注意的是，凋亡信号通路激活后，Caspase-3需要被裂解成为Cleaved Caspase-3才能发挥其剪切活性[20]。在本研究中，化合物GZWM-051促使HEL细胞Caspase-3蛋白表达水平下调，其剪切体Cleaved Caspase-3表达水平上调，说明化合物GZWM-051通过激活Caspase-3，引起细胞凋亡。Bcl-2家族由一组同源蛋白组成，同源区域目前发现有4个(BH1、BH2、BH3及BH4); Bcl-2家族可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，在调节细胞凋亡、肿瘤发生和细胞对抗癌治疗的反应等方面具有重要的作用[21]。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，作用于线粒体膜通透性，抑制细胞色素C的释放[12,22-23]。细胞色素C在凋亡过程中起中间作用，参与激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-9，而Caspase-9可以继续激活Caspase-3和Caspase-7，从而引起细胞凋亡[12,24]。本研究显示，0.025 μmol/L化合物GZWM-051处理24 h即可诱导HEL细胞凋亡，从而抑制细胞的增殖。化合物GZWM-051诱导HEL细胞抗凋亡蛋白Bcl-2下调，提示化合物GZWM-051通过内源性途径，提高线粒体膜通透性，增加细胞色素C的释放，激活凋亡下游通路，触发级联反应并促进细胞发生凋亡。

注：A、B为GZWM-051处理24 及48 h，C为柱状图；(1)与DMSO组比较，P<0.01。图2 不同浓度GZWM-051处理HEL细胞24及48 h时的细胞凋亡检测(流式细胞术)Fig.2 Compound GZWM-051 promoted HEL cell line apoptosis

图3 不同浓度GZWM-051处理HEL细胞后细胞凋亡现象(Hoechst33258染色，×200)Fig.3 Apoptosis of HEL cell line induced by compound GZWM-051

注：(1)与阴性对照组比较，P<0.01。图4 不同浓度GZWM-051处理HEL细胞后细胞凋亡相关蛋白表达水平Fig.4 Compound GZWM-051 affected relevant protein expression level of HEL cell

综上所述，双吲哚马来酰亚胺衍生物GZWM-051具有良好的抗白血病活性，是白血病患者的潜在治疗药物，其通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平和激活Caspase-3剪切体水平诱导HEL细胞凋亡。