封杏岚，黄程青，徐瀹澄，沈继云，解文涛，杨豫斐，何述栋

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230009）

0 引言

醇溶蛋白（Prolamin）是作物籽粒蛋白中溶于醇类的部分，占谷类成熟种子总氮的40%～60%[1]。醇溶蛋白具有良好的疏水、成膜、抗氧化[2]等功能，因而被广泛应用于食品、材料、纺织、医药等领域[3]。挖掘植物种子中醇溶蛋白的生产潜力，对于提高蛋白资源利用率、增加农作物附加值具有重要意义。芸豆（Kidney bean），又名扁豆、腰豆、饭豆，属豆科，蝶形花亚科，菜豆族菜豆属作物[4]，具有极高的营养价值，其主要成分为碳水化合物（37.6%～48.5%）和蛋白质（19.9%～20.0%）[5]。目前，鲜有针对芸豆醇溶蛋白的研究报道。试验以白芸豆为对象，通过单因素试验及响应面试验对提取工艺参数进行优化，为豆类中醇溶蛋白的提取提供借鉴，同时可为芸豆中蛋白质资源的精细化利用提供理论基础和试验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

云南大白芸豆，市售；纤维素酶（绿色木霉50 U/mg）、（果胶酶500 U/mg），上海源叶生物科技有限公司提供；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

SC-3614型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；LGJ-12型冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司产品；HX-300型高速中药粉碎机，浙江省永康市溪岸五金药具厂产品；CPll4型电子天平，奥豪斯仪器有限公司产品；HH-2型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司产品；85-2型恒温磁力搅拌器，江苏省金坛市城东新瑞仪器厂产品；101-3A电热恒温鼓风干燥箱，上海坤天试验室仪器有限公司产品。

1.3 原料预处理

选取饱满、洁白、无虫眼的白芸豆，粉碎并过80目筛，筛下粉用正己烷脱脂。配制成浓度为50 mmol/L浓度0.5 mol/L NaCl和1.0 mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液（pH值6.5），去除芸豆粉中清蛋白和球蛋白[6]，具体方法为：准确称取一定质量的脱脂芸豆粉，以料液比1∶10溶于缓冲液中，于室温下磁力搅拌2 h后，在4℃下离心（8 000 r/min，10 min），弃去上清液，沉淀用超纯水清洗3次后冷冻干燥备用。

1.4 芸豆醇溶蛋白提取

参考韩晶[7]的方法提取白芸豆中的醇溶蛋白。称取预处理后的芸豆粉20 g，加入乙醇溶液并在室温下搅拌2 h，使芸豆粉充分分散，水浴浸提后离心（8 000 r/min，15 min），收集上清液，沉淀重复浸提、离心2次，合并上清液，待45℃下旋转蒸发后，冷冻干燥得到醇溶蛋白粉。

1.5 醇溶蛋白得率计算

利用凯氏定氮法（参考国标GB 5009.5—2010）对蛋白质含量进行测定，计算醇溶蛋白的得率。

1.6 醇溶蛋白提取单因素试验

选择乙醇体积分数（50%，60%，70%，80%，90%，V/V），提取料液比 （1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，W/V），浸提温度 （10，20，30，40，50℃） 和浸提时间 （1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h） 进行单因素试验，考查其对醇溶蛋白得率的影响，根据试验需要固定提取料液比1∶10，浸提温度30℃，浸提时间2.0 h，每个单因素试验至少重复3次。

1.7 醇溶蛋白提取响应面试验

选择乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、浸提温度（X3）、浸提时间（X4）为优化因素，以醇溶蛋白得率（%）为响应值，采用四因素三水平中心组合设计 （Central Composite Design，CCD） 进行白芸豆醇溶蛋白提取试验。

响应面因素与水平设计见表1。

表1 响应面因素与水平设计

1.8 酶解处理对芸豆醇溶蛋白提取率的影响

选择纤维素酶和果胶酶对脱脂后芸豆粉进行酶解，探究酶解工艺对醇溶蛋白得率的影响。各组加酶量及条件为：①复合酶处理：0.5%纤维素酶+0.1%果胶酶，pH值5.0，180 min；②纤维素酶处理：0.5%纤维素酶，pH值5.0，180 min；③未加酶处理：料液比1∶10，酶解温度55℃，酶解时间3.0 h。酶解后将混合液离心，沉淀于40℃下烘干备用。

1.9 统计分析

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析，利用Design Expert 8.0.6进行响应面试验设计、结果分析及预测。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对白芸豆醇溶蛋白提取率的影响

乙醇体积分数对白芸豆醇溶蛋白得率的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对白芸豆醇溶蛋白得率的影响

由图1可知，醇溶蛋白得率随乙醇体积分数的升高而增大，并于70%时获得最大的提取量（1.75%±0.03%），当体积分数大于70%时，对于醇溶蛋白的提取效果反而有所下降。由方差分析结果可知，不同体积分数乙醇对于芸豆醇溶蛋白得率的影响差异显著，过高（90%）或过低（50%）体积分数都不宜于醇溶蛋白的溶出。醇溶蛋白的提取需要在一定体积分数的醇溶液中实现，有文献报道，玉米醇溶蛋白可溶解于50%～95%的乙醇溶液中[8]。陈晓萌等人[9]采用70%乙醇溶液对2种红芸豆中醇溶蛋白进行提取，其得率分别占总蛋白的6.79%和6.12%，间接印证上述试验结果。以上试验确定提取用最佳乙醇体积分数为70%。

2.2 料液比对白芸豆醇溶蛋白提取率的影响

料液比对白芸豆醇溶蛋白得率的影响见图2。

由图2可知，当料液比为1∶8和1∶10时均获得较大的醇溶蛋白得率，且1∶10时达到最高为1.76%±0.01%，但二者之间差异不显著；除此二者以外，无论料液比升高或是降低，均导致醇溶蛋白得率下降。一般而言，提取所用料液比越大，芸豆粉在溶液中的分散越充分，更有利于蛋白质的溶出。但过多的溶剂用量会造成分离和浓缩过程中混合液处理量增大，引起醇溶蛋白损失和提取成本增加；而较低料液比无法满足芸豆粉中蛋白质的充分溶出。综上原因并结合经济等因素，选择提取液料比为1∶10。

图2 提取液料比对白芸豆醇溶蛋白得率的影响

2.3 浸提温度对白芸豆醇溶蛋白提取率的影响

浸提温度对白芸豆醇溶蛋白得率的影响见图3。

图3 浸提温度对白芸豆醇溶蛋白得率的影响

当浸提温度低于30℃时，醇溶蛋白得率随浸提温度增加而上升，并于30℃时获得最大值（1.76%±0.01%）；随后在40℃时醇溶蛋白得率为1.72%±0.02%，与30℃时相比差异不显著；当浸提温度达到50℃时，醇溶蛋白得率迅速降低，此时仅为1.56%±0.42%。升高温度可引起溶剂中分子活动加剧，从而提高醇溶蛋白得率。但另一方面，乙醇作为沸点较低的易挥发性溶剂，随着浸提温度的升高不断逸出，表现为溶液体系中实际乙醇体积分数的下降，造成醇溶蛋白得率的降低。由图3可知，最优浸提温度为30℃。

2.4 浸提时间对白芸豆醇溶蛋白提取率的影响

浸提时间对白芸豆醇溶蛋白得率的影响见图4。

由图4可知，随着浸提时间的延长，各组醇溶蛋白得率不断增加，在3.0 h时获得最大值为1.80%±0.02%。从图4中各点形成趋势可明显看出，增加浸提时间可以增加醇溶蛋白提取率，故3.0 h为最佳浸提时间，但对于实际生产而言，提取水平的选择还需综合成本、时间等因素来考虑。

2.5 白芸豆醇溶蛋白提取响应面优化及结果分析

响应面中心组合试验设计及结果见表2。

通过Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行拟合，建立醇溶蛋白得率Y对乙醇体积分数X1、浸提液料比X2、浸提温度X3和浸提时间X4的多元回归方程如下：

图4 浸提时间对白芸豆醇溶蛋白得率的影响

表2 响应面中心组合试验设计及结果

由表3可知，回归方程p＜0.000 1，方程高度显著；失拟项p=0.637 9＞0.05，失拟结果不显著；同时模型相关系数R2=0.992 5，校正系数R2Adj=0.985 4，说明模型拟合效果良好，因此可通过以上回归方程确定醇溶蛋白提取最优工艺参数。影响醇溶蛋白得率因素的主次顺序为X2=X4＞X3＞X1，且选取的各因素均对醇溶蛋白得率影响显著或极显著。

方差分析见表3。

表3 方差分析

2.6 响应面分析及最优工艺参数确定

响应面分析诊断图见图5。

由图5可知，（a）中展示的残差正态分布概率近似分布在一条直线上，（b）中各点分布零散且无规律，而（c）中的点几乎在一条直线上，以上皆表明由响应面分析拟合的模型适应性良好。由表3可知，除乙醇体积分数和浸提温度外，其余因素间两两交互作用差异显著。

不同因素交互作用对醇溶蛋白得率影响响应面及等高线图见图6。

由图6可知，固定浸提温度和时间，醇溶蛋白得率随乙醇体积分数的增加呈上升后下降趋势，随料液比在一定范围内缓慢上升、（b）中乙醇体积分数和浸提温度在试验设计水平内交互作用不显著，固定浸提温度后，醇溶蛋白得率随乙醇体积分数先升高后下降，另一方面，得率随浸提温度升高也表现出相似趋势，但弱于乙醇体积分数造成的影响。从图6（c） 可看出，当乙醇体积分数位于“0”水平附近，同时浸提时间位于“1”水平附近时，可获得较高的醇溶蛋白提取量。（d）图表明，在固定浸提温度的情况下，提高液料比可以明显增加醇溶蛋白的提取率。（e）（f）两图均表明，固定其他3个因素的水平，延长浸提温度可有效提高醇溶蛋白得率。经该模型预测优化出的提取工艺参数为乙醇体积分数70%，料液比1∶9.2，浸提温度32℃，浸提时间2.9 h，预测得率为1.83%。采用以上参数进行验证试验，获得醇溶蛋白得率为1.78%，占芸豆中总蛋白质量的7.81%，与预测值相对误差为2.73%，表明预测模型较为可靠。

图5 响应面分析诊断图

2.7 酶解处理对白芸豆醇溶蛋白提取率的影响

酶解处理对白芸豆醇溶蛋白得率的影响见图7。

由图7可知，醇溶蛋白得率由大到小排列为：未加酶组（1.76%±0.03%）＞仅加纤维素酶组（0.90%±0.05%）＞纤维素酶+果胶酶（复合酶）组（0.70%±0.04%），且各组间存在显著差异。理论上认为，在芸豆粉脱脂之后进行纤维素酶、果胶酶处理，对芸豆粉中纤维素、半纤维素和果胶质等[10]进行酶解，破坏芸豆的细胞结构，利于蛋白质在后续醇提过程中的溶出。然而实际上，多步处理会造成蛋白质的损失；多糖类物质酶解后可能会竞争性降低蛋白质的溶解度；且豆粉容易出现结块，不利于乙醇溶液的浸提。综上原因，酶解处理不利于白芸豆中醇溶蛋白的提取。

3 结论

采用单因素试验分别考查乙醇体积分数、液料比、浸提温度和浸提时间对于醇溶蛋白得率的影响，最佳工艺参数为乙醇体积分数70%，料液比1∶10，浸提温度30℃，浸提时间3.0 h；通过响应面分析优化出最佳提取工艺，得到回归方程为：

图6 不同因素交互作用对醇溶蛋白得率影响响应面及等高线图

图7 酶解处理对白芸豆醇溶蛋白得率的影响

当乙醇体积分数70%，料液比1∶9.2，浸提温度32℃和浸提时间2.9 h时，醇溶蛋白得率可达到1.78%。和未加酶组相比较，酶解处理未明显提高醇溶蛋白的提取率。