于晓明，侯立婷，张元鹏，王义伟，乔绪稳，郑其升*，陈 瑾*， 侯继波

(1.国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014；2.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所，江苏南京210014；3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009)

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是一类动物传染病，主要侵害偶蹄动物。该病传播速度快、传染性强、危害严重，是我国强制免疫的动物疫病之一，疫苗免疫是控制和预防该病的主要手段[1]。但研究显示当前猪FMD 疫苗免疫30 d 后，抗体合格率仅26 %～60 %[2]，免疫后3 个月抗体水平显著下降；另外，对不同厂家的O 型FMD 疫苗进行免疫后的抗体水平监测，结果免疫后3 个月抗体基本下降到免疫保护临界值，表明疫苗免疫后实际抗体水平及保护期远达不到产品说明书标示的6 个月保护期[3-4]。如何提高疫苗免疫后的抗体水平，进而提升现有疫苗的免疫效力，已经成为当务之急。

现代疫苗免疫理论认为，高效疫苗必须包括3种成份：抗原、免疫增强剂和运送系统。免疫增强剂包括多肽、脂质、核酸、多糖、糖脂、脂多肽和糖多肽等。其免疫增强机制主要包括两条途径，一是免疫增强剂与抗原递呈细胞(DC)受体结合，激活先天性固有免疫系统，进而提高获得性免疫反应的强度和质量；二是免疫增强剂与T 淋巴细胞结合，能够直接提高特异性免疫反应的强度和质量[5]。本研究中的CVC1302 是经过大量体内、体外试验筛选获得的，含有单磷酰脂质A、胞壁酰二肽、β- 葡聚糖的复方免疫增强剂，将其用于猪FMD 疫苗，全面评价其免疫增强效果，为提高现有FMD 疫苗的免疫效力提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 单磷酰脂质A 购自北京邦定生物医学公司；胞壁酰二肽购自上海瀚鸿科技有限公司；β- 葡聚糖购自河北科隆多生物科技有限公司；猪O 型口蹄疫病毒(FMDV)MY98 株灭活抗原，由内蒙古金宇集团提供，完整的FMDV 粒子(146S)含量为8.7 μg/mL；ISA 206 佐剂购自法国SEPPIC 公司；50 日龄健康仔猪[液相阻断ELISA (LPB-ELISA)抗体滴度≤1:8]，由国家兽用生物制品工程技术研究中心实验猪场提供；O 型FMD 商品化灭活疫苗(批号：H160505J)、O/A/Asia-1 三价商品化灭活疫苗(批号：20160409)、FMD 合成肽商品疫苗(批号：2016090297522)由国家兽用生物制品工程技术研究中心提供；O 型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒(批号：20160811101-3)、A 型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒(批号：20160812102-1)、Asia I 型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒(批号：20160801101-2)购自中国农业科学院兰州兽医研究所；FMDV VP1结构蛋白抗体ELISA 试剂盒购自上海优耐特生物医药有限公司(批号：201608012)。

1.2 口蹄疫疫苗的配制 配制含不同剂量CVC1302的FMD 疫苗，CVC1302 高中低剂量见表1，对应制备的疫苗简称为FMD-CVC1302-H、FMD-CVC1302-M、FMD-CVC1302-L，不含CVC1302 的疫苗称为FMD (下同)。配制方法：将CVC1302 添加到FMD MY98 株抗原中混匀，制备成水相，再与ISA 206按照体积比46∶54 充分乳化，最终每头份(2 mL)含有3 μg 146S。

表1 每头份FMDV 中CVC1302 组分表Table 1 CVC1302 components per dose FMDV

1.3 免疫增强剂最佳免疫剂量的筛选 将40 头50日龄健康仔猪随机分为4 组，10 头/ 组，分别采用颈部肌肉注射免疫疫苗FMD-CVC1302-H、FMDCVC1302-M、FMD-CVC1302-L、FMD。免疫后28 d采血，分离血清，采用LPB-ELISA 试剂盒检测FMD抗体水平，分析数据，筛选免疫增强剂的最佳剂量(后续试验均采用筛选的最佳剂量作为佐剂免疫动物)。

1.4 含免疫增强剂的O 型FMD 疫苗的免疫持续期监测 将120 头50 日龄左右健康仔猪随机分为2组，60 头/ 组，分别经颈部肌肉注射免疫疫苗FMD-CVC1302 和FMD 对照组，2 mL/ 头。分别于免疫后28 d、60 d、90 d、120 d、150 d 与180 d 采血，分离血清，采用LPB-ELISA 试剂盒检测FMD抗体水平。

1.5 含免疫增强剂的FMD 疫苗对同源病毒的攻毒保护率试验 将32 头50 日龄左右健康仔猪，随机分为3 组：FMD-CVC1302 组(15 头)、FMD (15 头)组、PBS (2 头)组。FMD-CVC1302 组和FMD 组内又设3 个不同免疫剂量组，每组5 头，分别免疫1 头份剂量(2 mL/ 头)，1/3 头份剂量(0.67 mL/ 头)，1/9头份剂量(0.22 mL/ 头)；PBS 组猪免疫2 mL PBS。免疫后28 d 采血，分离血清，采用LPB-ELISA 方法检测FMD 抗体水平。免疫后28 d 对所有的猪经肌肉注射攻击1 000 半数感染量(PID50)O 型FMDV MYA98 株，攻毒后观察猪的临床症状，采用Karber法计算各组猪的半数保护量(PD50)，共观察10 d。

1.6 免疫增强剂对不同商品化疫苗的免疫效力评价

1.6.1 CVC1302 对O 型FMD 灭活疫苗的免疫效力评价将最佳剂量的CVC1302 添加到O 型FMD 灭活疫苗中，充分混匀。将60 头50 日龄左右健康仔猪，随机分为3 组，20 头/ 组，分别采用颈部肌肉注射免疫含CVC1302 的O 型FMD 灭活疫苗、O 型FMD 灭活疫苗和PBS。免疫后28 d 采血，采用O型FMD LPB-ELISA 检测血清中FMD 抗体水平。

1.6.2 免疫增强剂对O/A/Asia-1 三价灭活疫苗的免疫效力评价将最佳剂量的CVC1302 添加到O/A/Asia-1 三价灭活疫苗中，充分混匀。将100 头50 日龄左右健康仔猪随机分为3 组，分别采用颈部肌肉注射免疫含CVC1302 的O/A/Asia-1 三价灭活疫苗(40 头)、O/A/Asia-1 三价灭活疫苗(40 头)和PBS(20 头)。免疫后28 d 采血，分离血清，采用O 型、A 型与Asia-1 型FMD LPB-ELISA 检测各组猪对应亚型的抗体水平。

1.6.3 免疫增强剂对合成肽疫苗的免疫效力评价将最佳剂量的CVC1302 添加到合成肽疫苗中，充分混匀。将60 头50 日龄左右健康仔猪随机分为3 组，20 头/组，分别经颈部肌肉注射含CVC1302 的合成肽疫苗、合成肽疫苗和PBS。免疫后28 d 采血，分离血清，分别采用FMD LPB-ELISA 和FMDV VP1结构蛋白抗体ELISA 试剂盒检测各组猪的液相阻断抗体水平和VP1 结构蛋白抗体水平。

2 结 果

2.1 免疫增强剂最佳使用剂量的筛选结果 含免疫增强剂CVC1302 高中低剂量的FMD 疫苗免疫猪后28 d 采血，采用O 型FMD LPB-ELISA 试剂盒检测血清抗体水平。结果显示，FMD-CVC1302-M 组猪的平均抗体水平极显著高于其它两个组1 个滴度(p＜0.01)，抗体水平离散度小；FMD-CVC1302-H 组和FMD-CVC1302-L 组之间抗体水平无显著性差异(p＞0.05)(图1)。但与对照组相比，添加CVC1302的免疫组猪抗体提高约3 个滴度。结果表明，中间剂量的CVC1302 对提高O 型FMD 疫苗的免疫效果最好，且考虑实际应用的生产成本，确定CVC1302-M 为最佳剂量，后续试验选用该剂量免疫。

图1 CVC1302 最佳免疫剂量的筛选结果Fig.1 Screening for optimum immue dose of CVC1302

2.2 含免疫增强剂的O 型FMD 疫苗的免疫持续期监测 将FMD-CVC1302、FMD 疫苗分别免疫60 头仔猪，于免疫后28 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d 采血，监测抗体效价。结果显示，疫苗单次免疫后28 d，FMD-CVC1302 组猪的平均LPB-ELISA抗体效价为28，极显著高于FMD 组(p＜0.01)，免疫后180 d 猪的LPB-ELISA 抗体效价的平均值为27.7，合格抗体(LPB-ELISA 抗体效价≥26)持续期≥180 d(6 个月)，免疫后6 个月猪LPB-ELISA 抗体合格率高于90 %；而FMD 组猪在免疫后28 d 的平均LPB-ELISA 抗体效价为25，随着免疫时间的延长，抗体水平一直处于下降的趋势，免疫后6 个月已经检测不到LPB-ELISA 抗体[(当LPB-ELISA 抗体滴度小于1∶8 (即23)，为阴性)](图2)。表明含免疫增强剂CVC1302 的猪O 型FMD 疫苗单次免疫就可以显著提高该疫苗的免疫效力。

图2 O 型口蹄疫疫苗免后抗体持续期的检测结果Fig.2 Duration of immunity by O type FMDV vaccine of O type

2.3 含免疫增强剂的FMD 疫苗对同源病毒的攻毒保护率结果 50 日龄健康仔猪免疫不同FMD 及不同剂量FMD 疫苗后28 d 用O 型FMDV 攻毒，攻毒后10 d，FMD-CVC1302 所有免疫剂量组均无FMD临床症状的发生，能够达到100 %保护。免疫FMD 1 头份组猪攻毒后无临床症状，能够达到100 %保护；免疫1/3 头份组猪攻毒后1 头右蹄有水泡，攻毒保护率80 %；免疫1/9 头份组猪攻毒后第6 d、10 d 有3 头出现体温升高，蹄部出现水泡，跛行，攻毒保护率为40 %；对照组2 头猪在攻毒后第3 d出现明显的临床症状(表2)。表明免疫增强剂能够提高O 型FMD 疫苗对同源病毒的攻毒保护率。

表2 仔猪免疫各FMD 疫苗后的攻毒保护率Table 2 Protection ratio of FMDV challenge post FMD vaccination in piglets

2.4 免疫增强剂对不同商品化疫苗的免疫效力评价

2.4.1 CVC1302 对O 型口蹄疫灭活疫苗的免疫效力评价将不同的O 型FMD 灭活疫苗及PBS 分别免疫仔猪后，采用O 型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒检测其免疫效力。结果显示，FMD-CVC1302 组猪的平均LPB-ELISA 抗体效价为28.65，与FMD 组猪的平均LPB-ELISA 抗体效价25.15 相比，差异极显著(p＜0.01)，PBS 组猪的抗体水平均为阴性(LPB-ELISA 抗体滴度≤23)，添加CVC1302 后猪的抗体合格率由60 % (12/20)升至100 % (20/20)(图3)。表明免疫增强剂能够显著提高商品化O 型FMD疫苗的免疫效力。

2.4.2 CVC1302 对O/A/Asia-1 三价灭活疫苗的免疫效力评价将不同的三价灭活疫苗及PBS 分别分别免疫仔猪，利用3 种亚型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒检测其免疫效力。结果显示，含CVC1302的三价灭活疫苗组猪的O 型、A 型、Asia-1 型的抗体水平均极显著高于不含佐剂组(p＜0.01)，PBS 组猪的抗体水平均为阴性，添加CVC1302 后，猪O 型抗体的合格率由55 % (11/20)提高至82.5 % (33/40)，A 型抗体合格率由40%(8/20)提高至97.5%(39/40)，Asia I 型抗体合格率由20%(4/20)提高至60%(24/40)(图4)。表明免疫增强剂能极显著提高商品化O/A/Asia I 三价灭活疫苗的免疫效力。

图3 免疫猪O 型LPB-ELSA 抗体检测结果Fig.3 O type LPB-ELISA antibody titers of immunizatied piglets

2.4.3 CVC1302 对合成肽疫苗的免疫效力评价将不同的合成肽疫苗及PBS 分别免疫仔猪，分别利用O 型FMD LPB-ELISA 抗体检测试剂盒、FMDV VP1结构蛋白抗体ELISA 试剂盒检测其免疫效力。结果显示，合成肽-CVC1302 组猪的结构蛋白VP1 抗体水平(图5A)和LPB 抗体水平(图5B)均极显著高于合成肽疫苗组(p＜0.01)，VP1 结构蛋白抗体合格率由50 % (10/20)提高到100 % (20/20)，LPB 抗体合格率由25 % (5/20)提高到70 % (14/20)。表明免疫增强剂能够极显著提高商品化合成肽疫苗的免疫效力。

图4 免疫猪O、A、Asia 型LPB-ELISA 抗体检测结果Fig.4 Antibody tests of O/A/Asia immunizatied pigslets by LPB-ELISA

图5 免疫猪合成肽VP1 结构蛋白抗体水平(A)和LPB-ELISA 抗体水平(B)的检测结果Fig.5 Synthetic peptide VP1 induced antibody level (A)and LPB-ELISA antibody titers (B)of immunizatied piglets

3 讨 论

免疫增强剂有的先于疫苗免疫、有的与疫苗同时使用，能够增强机体对抗原物质产生特异性免疫应答的能力，越来越多的应用在疫苗免疫中[6]。常见的免疫增强剂有CpG、干扰素、多糖、细胞因子、细菌的鞭毛蛋白等[7-9]，并且有大量商品化的免疫增强型的佐剂上市。免疫增强剂使用方便，研发周期短，效果确实，且不改变疫苗的现有生产工艺，是提高疫苗免疫效力的有效手段。

CVC1302 的成份含有单磷酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖，这些成份是动物相关模式识别受体结合的配体，是天然的免疫受体激动剂[10-12]。在前期研究中，将单一组分添加到FMD 疫苗中抗体效价提升效果不明显，后续试验发现将其联合使用具有协同增效的作用。本实验在此基础上筛选CVC1302 的最佳使用剂量，检测结果表明其可以显著提高疫苗免疫后的抗体水平和延长其抗体持续期，增强疫苗的免疫效果。

Zhang Liu 等通过对免疫猪抗体水平监测，研究其体液免疫、细胞免疫水平与攻毒保护之间的关系。结果表明免疫猪的LPB-ELISA 抗体水平与攻毒保护率相关，抗体滴度越高，保护率越高，特别是在LPB-ELISA 抗体水平达到26后与攻毒保护率成正相关[13]。本研究中添加增强剂CVC1302 免疫组猪的LPB-ELISA 抗体效价均极显著高于不添加组。攻毒试验结果表明CVC1302 可以提高FMDV 免疫后的攻毒保护效力，与上述研究结果一致[13]。将CVC1302 添加到现有各类商品化FMD 疫苗中，均可以极显著提高各组猪免疫后的LPB-ELISA 抗体水平，表明CVC1302 具有良好的适用性，可以广泛应用于现有的疫苗生产中。

综上所述，CVC1302 能够显著提高现有FMD疫苗的免疫效力和攻毒保护率，具有较好的应用前景，对猪群FMD 的防控具有重要的临床意义。