方素芳　张宏英　黄明翔

【摘要】 目的：探討胶体金免疫层析法（LFA）检测血清隐球菌多糖荚膜抗原（CrAg）在肺隐球菌病诊断中的应用价值及其相关因素。方法：收集2017年3月-2018年3月在福建省福州肺科医院就诊的患者，诊断肺隐球菌病（PC）33例（A组），非PC30例（B组），均行LFA检测血清CrAg，并对结果阳性患者行抗原半定量测定。结果：A组LFA阳性27例，B组LFA均为阴性，LFA检测的敏感性为81.82%（27/33），特异性为100%（30/30），阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.33%。LFA阳性率分别在临床诊断分型为无症状、慢性、急性，三组患者阳性率比较差异有统计学意义（P=0.004），三组半定量滴度比较差异有统计学意义（F=4.085，P=0.030）;胸部影像分布为单侧单发、单侧多发、双侧多发，三组阳性率比较差异有统计学意义（P<0.001），单侧、双侧多发组半定量滴度比较差异无统计学意义（t=2.007，P=0.056）;胸部影像病灶为孤立结节或肿块<2 cm，多发结节或肿块≥2 cm，斑片实变浸润影，混合病变，四组阳性率比较差异有统计学意义（P<0.001），后三组阳性检出者抗原滴度比较差异无统计学意义（F=2.050，P=0.152）。结论：LFA-CrAg对肺隐球菌病的诊断具有重要的临床意义，其阳性率与临床及影像学表现有关，其半定量滴度受到临床表现的影响。

【关键词】 隐球菌抗原; 胶体金免疫层析法; 肺隐球菌病; 诊断价值; 因素

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.21.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）21-000-04

Diagnostic Value and Related Factors of Serum CrAg Detected by LFA in Patients with Pulmonary Cryptococcal Disease/FANG Sufang，ZHANG Hongying，HUANG Mingxiang.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（21）：-4

【Abstract】 Objective：To discuss the application and the relevant factors of using LFA to test Serum-CrAg in diagonizing pulmonary cryptococcosis.Method：Samples of patients who were treated from March 2017 to March 2018 in Fuzhou Lung Hospital in Fujian Province were collected.33 patients were diagonised Pulmonary Cryptococcosis （Group A），30 patients non-Pulmonary Cryptococcosis （Group B）.LFA was used to test their Serum CrAg.Semi-quantitative determination of antigen was given to those patients with Positive Result.Result：In group A，LFA was positive in 27 cases，and LFA in group B was negative.The suspectivity of LFA test was 81.82%（27/33） and its specificity was 100%（30/30）.The positive and negative predictive values were 100% and 83.33% respectively.The positive rate of LFA in clinical diagnosis was asymptomatic，chronic，acute，there was significant difference in the positive rate among the three groups（P=0.004），and there was significant difference in the semi-quantitative titer among the three groups（F=4.085，P=0.030）.The distribution of chest images was unilateral，multiple and bilateral，there was significant difference in the positive rate among the three groups（P<0.001）.There was no significant difference in the semi-quantitative titers between unilateral and bilateral multiple groups（t=2.007，P=0.056）.The chest imaging lesions were solitary nodules or masses<2 cm，multiple nodules or masses≥2 cm，spot consolidation infiltration，mixed lesions，there was significant difference in the positive rate among the four groups（P<0.001），but there was no significant difference in the antigen titer among the latter three groups （F=2.050，P=0.152）.Conclusion：LFA-CrAg is of clinical significance to the diagnosis of pulmonary cryptococcosis.Its positive rate is related to the clinical and imaging manifestations.Its semi-quantitative titer is affected by clinical manifestations.

【Key words】 Cryptococcal antigen; Lateral flow immunoehromatographieas say; Pulmonary cryptococcosis; Diagnostic value; Factor

First-authors address：Fujian Medical University Teaching Hospital，Fuzhou 350008，China

近年，随着隐球菌抗原检测技术发展，隐球菌抗原一胶体金免疫层析法（cryptococcal antigen lateral flow immunoehromatographieas say，CrAg.LFA）已成为诊断隐球菌病的重要手段;但其在HIV抗体阴性PC患者及对其结果的影响因素相关研究报道较少。本研究应用LFA检测HIV抗体阴性PC患者的血清CrAg，探讨其对PC的早期诊断价值及影响其结果的相关因素，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年3月-2018年3月就诊于福建省福州肺科医院经病理活检、隐球菌荚膜多糖抗原等诊断明确PC患者33例为观察组（A组）;并同期选择临床明确诊断的肺结核、肺癌及普通细菌性肺炎30例为对照组（B组）。排除标准：HIV感染或确诊AIDS患者。PC组患者，男19例，女14例，年龄18～70岁，平均47.2岁。非PC患者，男17例，女13例，年龄20～75岁，平均51.4岁，其中肺结核、肺炎及普通细菌性肺炎分别为13、8、9例。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂 隐球菌抗原检测胶体金试剂由美国Immuno-Mycologies有限公司生产。

1.2.2 标本采集 常规无菌操作抽取静脉血约4 ml于无菌干燥采血管中，并于水平离心仪3 000 r/min离心 ，10  min后取血清。

1.2.3 标本测定 将1滴样本稀释液加入到无菌试管中，加入40 μl血清样本进行混合，将隐球菌抗原检测试纸条检测端插入混合样本液中，10 min后读取结果。结果判读：检测条带和对照条带均出现为阳性;仅出现对照条带为阴性;若对照条带未出现，说明检测无效，应重新检测。结果阳性则进行半定量滴度检测，向1号试管中加入4滴样本稀释液，分别向标号2～10号的试管中加入2滴滴定液;将40 μl样本加入1号试管并混匀。从1号试管中吸取80 μl样本混合转移到2号试管并混匀。依次进行稀释检测，直到测量结果为阴性。

1.3 观察指标及评价标准

观察两组LFA检测血清CrAg定性情况，并对定性阳性患者行抗原半定量测定;通过两组抗原定性情况统计分析其灵敏度、特异度及阳性预测值、阴性预测值。并观察PC组LFA检测CrAg的定性及半定量结果与其基础疾病、临床诊断分型及胸部CT影像表现进行相关性统计分析[1]，判断LFA检测血清CrAg定性及半定量值对PC诊断价值及其影响因素。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件及Excel进行统计分析，正态分布计量资料以（x±s）表示，非正态分布计量资料以中位数表示，计数资料以率（%）表示。组间比较采用Fish精确概率及Bonferroni法校正多重比较，对LFA半定量测定值通过几何均数后再将其滴度倒数进行常用对数转换，并对转换后的数据进行成组配对t检验及单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PC组与非PC组血清LFA检测情况比较

63例患者均行LFA检测，33例PC患者其中经支气管镜肺活检术（TBLB）11例、行胸腔镜手术6例、行CT引导下肺穿刺术16例，LFA检测阳性27例;非PC组30例患者均为阴性。对27例阳性患者进行半定量测定，其滴度为1∶5～1∶5 120;

LFA诊断PC的敏感度为81.82%（27/33），特异度为100%（30/30），阳性预测值100%，阴性预测值83.33%（30/36）。

2.2 PC组血清LFA检查结果及其相关的因素

2.2.1 基础疾病对PC组血清的LFA检测结果的影响 33例PC患者有基础疾病15例，其中肾移植术后1例，糖尿病4例，恶性肿瘤4例，肾病综合征及类风湿关节炎各2例，支气管扩张伴陈旧性肺结核1例，慢性阻塞性肺部疾病1例，慢性乙型肝炎1例，高血压病2例;无基础疾病者18例。两组患者LFA阳性率比较差异无统计学意义（P=0.185）;有无基础疾病组患者半定量几何均数分别为1∶76.1、1∶116.2，两者阳性检出者抗原滴度比较差异无统计学意义（t=0.597，P=0.556），见表1及图1。

2.2.2 临床诊断类型对PC组血的LFA检测结果影响 33例均为单纯PC患者，其中体检时发现肺部阴影9例（27.3%）;临床症状24例（72.7%），其中咳嗽23例，咳痰21例，气喘7例，胸痛2例，发热2例，乏力1例。急性确诊、慢性确诊与无症状确诊三组患者阳性率比较差异有统计学意义（P=0.004），其中慢性组检出率显著高于无症状组，Bonferroni法校正P=0.029。三组半定量滴度的几何均数分别为1∶353.3、1∶45.6、1∶160.0，其平均水平比较差异有统计学意义（F=4.085，P=0.030）;使用Bonferroni法进行多重比較，急性组滴度与慢性组比较差异有统计学意义（P=0.032），见表2及图2。

2.2.3 胸部CT影像学表现对PC组血清的LFA检测结果的影响 根据胸部CT病灶分布分为单侧单发、单侧多发、双侧多发，三组阳性率比较差异有统计学意义（P<0.001）;各组间两两比较使用Bonferroni法校正，显示双侧多发组阳性率高于单侧单发组（P<0.001），单侧多发组阳性率高于单侧单发组（P=0.008）。LFA半定量滴度单侧单发者仅1例为1∶5，而单侧、双侧多发组半定量滴定的几何均数分别为1∶31.7、1∶149.3，两组滴度比较差异无统计学意义（t=2.007，P=0.056），见表3、图3。按胸部影像特点分为肺部孤立结节或肿块<2 cm（即单侧单发者），多发或结节、肿块≥2 cm，斑片实变浸润影，混合病变，四组阳性率比较差异有统计学意义（P<0.001）;各组间两两比较使用Bonferroni法校正，结果显示多发组、斑片组与混合组阳性检出率均高于孤立组（P<0.001、P=0.015、P=0.001）。其后三者LFA半定量滴度几何均数分别为1∶58.4、1∶367.6、1∶105.6，三组阳性检出者抗原滴度比较差异无统计学意义（F=2.050，P=0.152），见表3、图4。

其伴隨影像表现：伴随空洞征8例、支气管充气征5例、磨玻璃影5例、胸腔积液1例、纵隔淋巴结肿大1例的患者，其血清LFA检测均为阳性。由于病例数较少及分散未进行统计分析。

3 讨论

肺隐球菌病是由隐球菌感染引起的一种急性、亚急性或慢性的呼吸系统真菌病。隐球菌侵袭机体感染后，其菌体的荚膜多糖抗原释放入血，通过乳胶凝集试验（CrAg-latex）、胶体金免疫层析法（LFA）检测荚膜多糖抗原是隐球菌病诊断的首选方法[2]。但因LFA检测不需要对样品进行修饰、对各种隐球菌亚种血清型的高敏感度特异度、设备要求低、快速、低成本等因素[3]，近年LFA在临床上得到广泛的应用，据国内外报道针对HIV感染或免疫受损为主的隐球性脑膜炎或隐球菌败血症患者，其LFA检测的特异度达95.0%～99.1%、灵敏度达95%～99.3%[4-6]。

但对非HIV的PC患者报告，灵敏度则较前降低，Kohno等[7]研究显示157例患者其LFA检测灵敏度为78.8%;国内学者李小华等[8]及胡群等[9]通过兔肺隐球菌感染模型及非HIV的PC研究显示其血清LFA敏感度为80.0%～89.4%，特异度均为100%;黄佳斯等[10]从547例患者血清LFA检测其灵敏度为80.0%;特异性为99.4%，阳性预测值为72.7%和阴性预测值为99.6%。本研究显示在非HIV感染的患者其血清CrAg的LFA测定的敏感性为81.82%，特异性为100%，阳性预测值和阴性预测值分别为100%和83.33%，与前面报道是相一致的;比LFA在感染HIV的隐球菌病患者的检测在特异度相当，而其灵敏度偏低;分析考虑与患有HIV感染或机体免疫受损患者免疫状态较差，隐球菌感染后患者病情较重及病灶较广泛所致抗原入血较快较多，以致检测阳性率更高的可能。

LFA检测结果是否与机体基础疾病、临床表现、影像学变化等相关，目前研究较少。McKenney及Souleymane等[11-12]报道在HIV感染的人群中其CD4计数与LFA阳性率有关。国内王丽芳等[13]曾报告LA检测隐球菌抗原在重症及累及2个以上脏器者的阳性率高，其半定量的滴度与肺部病灶范围和疾病严重程度有相关性。并结合Anupop等[14]报道LFA与LA检测比较，显示其一致性及其滴度值有相关性;所以，综合分析LFA检测血清-CrAg其结果可能受到类似因素的影响。

从本研究发现患有糖尿病、恶性肿瘤、器官移植、长期使用免疫抑制剂等患者与无基础疾病患者在LFA阳性率及半定量抗原测定值方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），支持Kohno等[7]报告的PC患者LFA抗原检测结果与有无基础疾病无关;对于急性确诊、慢性确诊、无症状PC患者LFA阳性率及半定量比较差异有统计学意义（P<0.05），提示临床表现对于LFA阳性及其半定量值是有影响的;其中急性确诊比慢性确诊在两者检测结果方面影响更显著。也支持了病情较重的患者其抗原检测阳性率及半定量滴度更高的可能。

从影像学病变累及范围及影像特点是否与LFA结果阳性及半定量分析来看，发现病灶分布为单侧多发、双侧多发及特点为多发或结节、肿块≥2 cm，斑片实变浸润影，混合病变阳性检出率及半定量滴定值均显著高于单侧孤立的病灶为14.28%的阳性率及1∶5半定量值;而其他组差异均无统计学意义（P>0.05）。并其伴随空洞、支气管充气征、磨玻璃影、胸腔积液、纵隔淋巴结肿大特点的患者，其血清LFA检测均为阳性，考虑此类患者的临床表现一般较重或病情较急需。从影像结果分析支持Baddley等[15]及Pappas等[16]曾报道PC病灶局限的患者血清中通常难以检测到隐球菌抗原，存在敏感性不足的，可能是隐球菌在肺部局限性浸润生长，隐球菌抗原较难释放人血有关，而病灶多或累及较广的患者，其隐球菌抗原释放入血较快较多;所以，肺部病灶表现与其释放入血的隐球菌荚膜抗原量有关。

本研究从临床症状、影像学表现与傅顺金等[17]报道PC患者中其血隐球菌荚膜多糖抗原检测阳性占63.46%，而其中咳嗽咳痰占75.00%，影像表现为浸润实变者占79.17%，结节或肿块型者仅占41.00%相符。分析患者的咳嗽、咳痰、气急、发热等症状及影像的多发、斑片实变影、空洞等，其存在其机体细菌负荷量更大、细菌菌壁多糖荚膜抗原更易释放入血及入血量更多可能，以致LFA检测阳性率及半定量测定值更高[18]。

综上所述，具有快速、方便、对设备要求低的LFA检测方法因其高特异性、对临床表现或肺部多发病灶的PC患者的高灵敏度等特点，以及有报道实现未梢血的床旁快速检测的开展，其无疑成为PC患者的临床上最重要最早的检测方法;并且其阳性结果以及半定量滴定与病情轻重存在相关性，对临床有一定指导意义。本文对探索LFA检测其结果涉及的相关因素上存在病例数较少，今后将扩大样本量继续其相关性的研究。

参考文献

[1]曾能永，徐云欢，孔晋亮.肺隐球菌病诊治进展[J].国际呼吸杂志，2016，36（3）：218-223.

[2] World Health Organization.Rapid advice on the diagnosis，prevention and management of cryptococcal disease in Hiv-infected adults，adolesents and children[EB].2011，Geneva：WHO.

[3] Vidal J E，Boulware D R.Lateral flow assay for cryptococcal antigen：An important advance to improve the cintinuum of hiv care and reduce cryptococcalmeningitts-related mortality[J].Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2015，57（Suppl 19）：38-45.

[4] Huang H R，Fang L C，Rajbanshi B，et al.Evaluation of a new cryptococcal antigen lateral flow immunoassay in serum，cerebrospinal fluid and urine for the diagnosis of cryptococcsis：A meta-analysis and systematic review[J].PLOS One，2015，10（5）：e0127117.

[5]季淑娟，倪玲红，张俊丽，等.不同荚膜抗原检测方法对隐球菌脑膜脑炎诊断和疗效评估的价值[J].中华医学杂志，2015，95（46）：3733-3736.

[6]浙江省医学会呼吸病学分会.肺隐球菌病诊治浙江省专家共识[J].中华临床感染病志，2017，10（5）：321-326.

[7] Kohno S，Kakeya H，Izumikawak K，et al.Clinical features of pulmonany cryptococcosis in no-HIV patients in Japan[J].Infect Chemother，2015，21（1）：23-30.

[8]李小华，赖国祥，许昌声，等.兔肺隱球菌感染模型制作及荚膜多糖胶体金免疫层析法的诊断价值[J].国际呼吸杂志，2018，38（10）：725-730.

[9]胡群，徐礼裕，张雷，等.血胶体金免疫层析法对非人免疫缺陷病毒感染的肺隐球菌病患者的诊断价值[J].中华结核和呼吸杂志，2018，41（8）：651-653.

[10]黄佳斯，石磊，唐爱国，等.胶体金免疫层析法检测血清隐球菌抗原在肺隐球菌病诊断中的应用价值[J].临床检验杂志，2017，35（7）：518-519.

[11] McKenney J，Bauman S，Neary B，et al.Prevalence，Correlates，and Outcomes of Cryptococcal Antigen Positivity Among Patients With AIDS，United States，1986-2012[J].Clin Infect Dis，2015，60（6）：959-965.

[12] Souleymane S，Boniface M，Anne P，et al.Estimated Prevalence of Cryptococcus Antigenemia（CrAg） among HIV-Infected Adults with Advanced Immunosuppression in Namibia Justifies Routine Screening and Preemptive Treatment[J].PLoS One，2016，11（10）：e0161830.

[13]王丽芳，施毅，丁媛，等.65例肺隐球菌病回顾分析[J].中华结核和呼吸杂志，2014，37（10）：764-768.

[14] Anupop J，Anil A.Panackal Peter R.Williamson etal.Performance of the Cryptococcal Antigen Lateral Flow Assay in Non-HIV-Related Cryptococcosis[J].Clin Microbiol，2016，54（2）：460-463.

[15] Baddley J W，Perfect J R，Oster R A，et al.PulmonarycrptococcosisinpatientswithoutHIV infection：factor eyrycryptococcosisin patientswithoutHIVinfection：factorsassociatedwithdisseminated disease[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（10）：937-943.

[16] Pappas P G，Perfect J R，Cloud G A，et al.Cryptococcosis in human imnlunodeficiency virus-negative patients in the era of effective azole therapy[J].Clin Infect Dis，2001，33（5）：690-699.

[17]傅顺金，许攀峰，周华，等.52例肺隐球菌病的临床及影像特点与隐球菌荚膜抗原检测结果的关系[J].中华医院感染学杂志，2018，28（22）：3397-3400，3409.

[18] Admasu T M，Ethan B，Obsie T.Point-of-Care Testing for Cryptococcal Disease among Hospitalized Human Immunodeficiency virus-Infected Adults in Ethiopia[J].Am J Trop Med Hyg，2016，95（4）：786-792.

（收稿日期：2019-06-12） （本文编辑：马竹君）