高效液相色谱法同时测定油脂中抗氧化剂TBHQ、BHT及其转化产物

2019-09-28陈华凤

质量技术监督研究 2019年3期

王毅，陈华凤，刘刚

（1 四川省食品药品检验检测院，四川成都 610100）

（2资阳市农产品质量监测检验中心，四川资阳641300）

1 引言

抗氧化剂提供的活泼氢可以与油脂氧化过程中产生的活性自由基结合，阻断自由基链式反应，减缓油脂的氧化变质。一般来说，食品抗氧化剂可分为天然抗氧化剂和合成抗氧化剂两类[1]。目前天然抗氧化剂主要有维生素类，黄酮类、多酚类、皂苷类、鞣质类等，但天然抗氧化剂提取困难，价格、用量和抗氧化效果都不能满足现代食品工业的规模生产的需要[2]。相比之下，合成抗氧化剂的种类、价格和抗氧化效果均要优于天然抗氧化剂，目前国际上已开发出上百种化学合成抗氧化剂，但被各国普遍认可、较安全、高效且使用量较大的主要有叔丁基对苯二酚（TBHQ）、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等合成酚类抗氧化剂。我国食品安全国家标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》对TBHQ和BHT的最大使用量做出了明确规定（≤0.2g/kg）[3]。

在诸多合成酚类抗氧化剂中，TBHQ在同等情况下的抗氧化剂性能优于其他抗氧化剂，BHT价格较低，化学性质稳定，且遇碱不变色，可以与TBHQ互补使用，基于以上优点，TBHQ和BHT往往单一或者联合用于油脂制品的抗氧化[4]。实验证实，在加热条件下，油脂中的TBHQ和BHT主要以挥发为主[5-6]。此外，还有少量的转化产物生成。近年来，国内外学者陆续开展了TBHQ和BHT在加热条件下转化产物的研究，Hamama[7]和李军等[8]对含有TBHQ的油脂进行加热实验，实验结果表明：TBHQ加热时的主要转化产物是2-叔丁基对苯醌（TQ）。Warner等[9]证实BHT经高温加热后会有2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q）生成，Hamama等[7]将BHT置于185℃高温下加热1h后，通过GC-MS测试发现了转化产物2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP）。

尽管TBHQ和BHT转化产物的研究取得了一些成果，但分析检测方法鲜有报道[10]。文中在前期研究的基础上，以TBHQ、BHT转化产物TQ、BHT-Q和TBP作为主要分析对象，建立了高效液相色谱同时检测TBHQ、BHT及其特征转化产物的分析方法，以期实现对TBHQ和BHT使用全过程的监控。

2 材料与方法

2.1 实验仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（DAD检测器、二元泵、柱温箱、自动进样器、Chemical Station 色谱工作站，美国Agilent公司）；TI-H5MF2型超声波清洗器（德国Elma公司）；Milli-Q纯水系统（美国 Millipore公司）；H2050R型高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；FA2004N型分析天平（感量0.0001g）（上海菁华公司）。

2.2 实验试剂耗材

乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）、超纯水（Milli-Q纯水系统制备）、微孔滤膜（有机系，0.22μm）、色谱柱：Sunfire C18，4.6mm×250mm，5μm（美国Waters公司）；ODS C18吸附剂,50μm, 60Å, 100g（天津博纳艾杰尔科技有限公）。

2.3 对照品

叔丁基对苯二酚（TBHQ，纯度≥97.8%）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，纯度≥99.9%）、2-叔丁基对苯醌（TQ，纯度≥98.0%）购至上海安谱实验科技股份有限公司；2-叔丁基-4-甲基苯酚（TBP，纯度≥99.0%）和2,6-二叔丁基苯醌（BHT-Q，纯度≥99.0%）购至北京百灵威科技有限公司。

2.4 色谱分析条件

色谱柱：Sunfire C18, 4.6mm×250mm,5μm；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：280nm；流动相：（A水，B乙腈），运行梯度洗脱程序：0.00min～3.00min 45%A～45%A，3.00min～7.00min 45%A ～ 25%A，7.00min～ 7.50min 25%A～2%A，12.00min～12.10min2%A ～45%A，12.10min～ 16.00min45%A ～ 45%A。

2.5 标准溶液的配制

标准储备液的配制：精密称定TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP标准物质0.0250g，乙腈溶解并定容至25mL，得到浓度为1000mg/L的标准储备液，4℃避光保存。

标准工作液的配制：分别准确吸取1mL TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP的标准储备液（1000 mg/L）于10mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至10mL，得到质量浓度为100mg/L 的标准使用液。逐级稀释标准使用液得到质量浓度分别为0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0 mg/L的标准溶液。

2.6 提取与净化

准确称取1.0g油样于在50mL离心管中，加入5mL正己烷，涡旋1min，加入5mL正己烷饱和乙腈超声提取10min，冷冻离心10min，收集乙腈层于离心管中，重复用10mL正己烷饱和乙腈提取2次，合并3次提取液，提取液-10℃冷冻2h后加入5g C18吸附剂，振荡提取10min，冷冻离心，过滤除去C18粉末，收集滤液40℃旋转蒸发至干，加入1ml乙腈溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，供液相色谱测定。

3 结果与讨论

3.1 加热条件下TBHQ和BHT转化产物的可能转化机理

如图1所示，氧化反应初期，TBHQ和BHT均可失去一个氢生成酚氧自由基中间体（中间体II和中间体IV），其中TBHQ的酚氧自由基中间体IV通过分子内电荷转移可以生成较稳定的转化产物TQ。BHT的酚氧自由基中间体II与III互为共振式，中间体III与过氧化物作用，通过分子内消除反应生成稳定的转化产物BHT-Q。

BHT的转化还有另外一条途径，活性氢首先对BHT的苯环亲电加成，生成中间体I，随后脱去叔丁基生成转化产物TBP。

图1 加热条件下TBHQ和BHT转化产物的可能转化机理

3.2 样品前处理方案的选择与优化

油脂制品前处理时加入正己烷可以降低体系的粘度，这将有利于待测化合物的提取。此外，利用极性溶剂与油脂不相溶的特性，可以使用极性溶剂提取油脂中的待测极性组分[11]。前期研究结果表明，乙腈的提取效果优于甲醇[12-13]，为了降低乙腈在正己烷中的溶解性，本实验采用正己烷饱和的乙腈作为提取溶剂。

一般来说，脂类等非极性组分是样品提取过程中的主要干扰物，文献报道采用中性氧化铝柱[14-15]，C18柱[16]等固相萃取方式净化除去。虽然固相萃取的净化效果较好，但实验成本较高，耗时较长，不利于大批量样品的快速检测。此外，凝胶渗透色谱[17]也用于了样品前处理的研究，需要指出的是，该方法不但耗时长，而且净化过程中还会用到大量的有机溶剂，对环境的污染极大。因此，上述前处理方法均不利于实验室大批量样品的检测。随着QuEChERS技术的出现，快速、高效、低毒的前处理方式得到了人们的推崇，2018年，陈果等[18]设计了基于QuEChERS原理的前处理方案，采用C18-MgSO4作为净化剂，C18反相色谱柱分离，获得了理想的结果，各组分的回收率均在90%以上。笔者在研究中发现MgSO4不是净化油脂所必须的成分（MgSO4主要用于吸附样品中多余的水分，但油脂制品中几乎不含水），在多次实验的基础上，提出了冷冻离心-C18吸附净化的方案。实验证实，该方法具有快速、简便、易操作，成本低廉的优点，有利于实验室大批量样品的快速检测。

3.3 液相色谱条件选择与优化

已有较多的文献报道了TBHQ和BHT的液相色谱分离条件：使用甲醇/乙腈作为有机相，通过加入了不同比例的盐[19]、酸[20-21]改善化合物的分离和峰形。笔者首先尝试使用甲醇作为有机相，1.0%乙酸-水作为水相进行分离，BHT和BHT-Q在此色谱条件下不能达到基线分离，有机相换用乙腈后，BHT和TBHQ获得了较好的分离。为了减少酸体系对色谱柱的损害，提高色谱分析系统的稳定性，笔者尝试使用纯水代替1.0%乙酸-水。如图2所示，TBHQ、BHT及其转化产物在该色谱条件下均获得了较好的分离效果。

图2 TBHQ、BHT及其转化产物的液相色谱分离图谱

3.4 方法线性范围

分别配制TBHQ、BHT、TQ、BHT-Q和TBP不同浓度梯度的标准溶液，其浓度依次为0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，20.0mg/L，50.0mg/L，按照2.4所示的色谱条件进行检测，以峰面积（y）为纵坐标，浓度（x，mg/L）为横坐标绘制标准工作曲线，各组分的线性回归方程见表1所示。测试结果表明，在0.5mg/L～50.0mg/L范围内，TBHQ、BHT及其转化产物具有良好的线性关系，相关系数（2）大于 0.999。

表1 本方法的回归方程、相关系数

3.5 方法精密度、回收率和检出限

本实验采用空白大豆油加标的方式进行方法精密度、回收率和检出限实验。TBHQ、BHT及其转化产物的添加水平为1.0mg/kg、10.0mg/kg，按2.4所示的色谱条件，2.6所示的前处理方法进行实验，每一样品重复平行测定6次。测试数据见表2所示，TBHQ、BHT及其转化产物的回收率在72.6%～101.2%之间，相对标准偏差（RSD）小于4.5%，检出限范围为3mg/kg～10mg/kg。