白 海，董润宇，赵 轲， 陈利东

（1.山西大同大学生命科学学院，山西大同 037009；2.山西大同大学设施农业技术研发中心，山西大同 037009）

枯草芽孢杆菌是一种容易保存的好氧型革兰氏阳性杆状菌，无毒无害，在极端的条件下，可以诱导产生抗逆性很强的内生孢子；因其含有芽孢，故抗热能力非常强，在60℃高温下可以长期保持活性，耐高温、耐酸碱、耐挤压；对提高动物的免疫力也有一定的作用（秦瑶，2014）。邵丽玮等（2015）发现，在LB液体培养基中分别添加4 mg/mL菊糖、2.4 mg/mL果寡糖、0.4 mg/mL黄芪多糖和0.8 mg/mL白术多糖后，枯草芽孢杆菌达到很好的增殖效果，其中添加量为0.8 mg/mL白术多糖对枯草芽孢杆菌的增殖效果最好。黄建烨等（2012）研究发现，果寡糖（FOS）与枯草芽孢杆菌和非淀粉多糖酶制剂联用对广西黄羽肉鸡种鸡的产蛋质量和增进健康的效果要优于单独使用。朱沛霁等（2016）研究发现，枯草芽孢杆菌 048（BS048）和果寡糖的联用，不仅能够降低雪山草鸡小肠食糜黏度，还可以增强其肠道的消化功能，促进盲肠中挥发性脂肪酸（VFA）的产生，维持和改善雪山草鸡的健康状况，从而提高其生长性能；廉俊红（2016）研究也有类似的结果。本试验比较了香蕉多糖、山楂多糖和菊糖对枯草芽孢杆菌增殖效果的影响，从而准确的筛选出植物多糖对枯草芽孢杆菌的最适宜添加量，以期为以后设计良好的合生元产品提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料 枯草芽孢杆菌由微生物实验室保存提供；香蕉多糖和山楂多糖购自兰州沃特莱斯生物科技有限公司（纯度都为50%）；菊糖购自九芹健康养生馆（纯度92%）。

1.2 试验仪器 恒温摇床GW-D（国旺仪器）；紫外分光光度计UV-1200（上海谱达仪器）；超低温冰箱（青岛海尔公司）；立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）；超净工作台等。

1.3 枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制及最佳培养时间的确定 250 mL的锥形瓶中移入99 mL LB培养液和1 mL菌液，培养30 h（37℃，150 r/min的摇床培养箱）， 之后分别在第 0、2、4、6、8 、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 取出部分菌液测量其OD值（600 nm），用紫外/可见分光光度计测量，绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线并确定其最适宜培养时间。

1.4 确定3种植物多糖的最适宜添加量 将LB液体培养基作为基础培养基，将提前制备好的菌液 加 入 添 加 量 为 5、10、15、20、25、30、40 mg/mL和50 mg/mL的山楂多糖溶液和香蕉多糖溶液，添加量为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mg/mL 和5.0 mg/mL的菊粉糖溶液中，接种量为5%（文宇婷，2012）。同时用不添加多糖溶液的LB液体培养基作对照。置于37℃、150 r/min摇床培养箱中开始培养，分别在第 3、4、5、6、7、8、9、10 h 时取出相应的样品，每个样品三个重复，在600 nm紫外/可见分光光度计下测定其OD值。

1.5 比较3种植物多糖的增殖效果 将从1.4中筛选出来的三种植物多糖对促进枯草芽孢杆菌增殖的最适宜添加量进行比较，同时以LB液体培养基来作为对照。

1.6 数据处理 所有的结果用“平均值±标准差”表示，用Microsoft Excel软件作图和SPSS 20.0软件进行试验数据的分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线以及最适培养时间枯草芽孢杆菌在LB液体培养基进行培养（37℃、150 r/min 的摇床培养箱中）， 在第 0、2、4、6、8 、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 时 测 量其OD值（紫外/可见分光光度计），测量的OD值见表1，根据表1得到的OD值绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线（图1）。

表1 枯草芽孢杆菌培养30 h所测的OD值

从表1和图1中可见，枯草芽孢杆菌刚开始生长速度比较缓慢，从第2 h之后，生长速度持续加快，开始呈现对数增长，并在第6～8 h时到达生长速度的峰值。之后枯草芽孢杆菌的生长速度逐渐减慢，从稳定期开始慢慢进入衰亡期。结果表明，枯草芽孢杆菌最适宜的培养时间是8 h。

图1 枯草芽孢杆菌生长曲线图

2.2 3种植物多糖对枯草芽孢杆菌生长性能的影响

2.2.1 香蕉多糖对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响从图2可知，不同添加量的香蕉多糖对枯草芽孢杆菌的增殖效果不同。添加量为50 mg/mL的香蕉多糖对枯草芽孢杆菌的增殖效果最好，其次是添加量为25 mg/mL的香蕉多糖；其他添加量从10 mg/mL到40 mg/mL的香蕉多糖对枯草芽孢杆菌的增殖效果依次升高。

图2 香蕉多糖对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响

2.2.2 山楂多糖对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响 从图3可知，添加量为5、10 mg/mL对枯草芽孢杆菌的增殖没有效果，添加量为15 mg/mL可明显促进枯草芽孢杆菌增殖，然而当添加量为20 mg/mL时又抑制了枯草芽孢杆菌的增殖。当添加量为25 mg/mL及以上时，又可促进枯草芽孢杆菌的增殖。总体上来说，添加量为15 mg/mL效果最好。

2.2.3 菊粉对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响 从图 4 可知， 添加量为 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 和2.5 mg/mL的菊粉对枯草芽孢杆菌的增殖都有一定的促进作用，其中添加量为2.5 mg/mL的菊粉促进效果最好。当菊粉的质量浓度超过2.5 mg/mL时，枯草芽孢杆菌的生长开始变得迟缓。

图3 山楂多糖对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响

图4 菊粉对枯草芽孢杆菌增殖情况的影响

2.3 三种不同多糖对枯草芽孢杆菌增殖效果和成本的比较 如表2所示，经折算，购买香蕉多糖的价格是每克0.282元、购买山楂多糖的价格是每克0.300元、购买菊粉的价格是每克0.082元；根据结果可知添加量为50 mg/mL的香蕉多糖、添加量为15 mg/mL的山楂多糖和添加量为2.5 mg/mL的菊粉对枯草芽孢杆菌的增殖效果很好，其中质量浓度为15 mg/mL的山楂多糖对枯草芽孢杆菌增殖性能的影响效果是最好的，然而从成本上考虑，添加菊糖是最经济的。

表2 三种植物多糖的成本比较

3 讨论

本试验通过绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线图，发现枯草芽孢杆菌的指数生长期是第2～10 h，在第8 h时枯草芽孢杆菌的生长达到峰值，从而确定枯草芽孢杆菌的最适宜培养时间。

文宇婷等（2012）报道，黄芪多糖-枯草芽孢杆菌合生元菌液的研制方法，最大限度地减少两者的使用量；邵丽玮等（2015）研究了白术多糖、黄芪多糖、菊糖和果寡糖对枯草芽孢杆菌的增殖效果，从而筛选出上述植物多糖的最适添加量。本试验选用香蕉多糖、山楂多糖和菊糖，其中香蕉多糖和山楂多糖是水果多糖，有多种生物活性（吕玲霞等，2016；沈建林等，2015），而菊糖还是优良的水溶性膳食纤维，将枯草芽孢杆菌种子液中加入不同添加量的多糖溶液， 分别在第 3、4、5、6、7、8、9 h和第10 h测量其OD值并记录其生长情况。发现香蕉多糖的添加量为50 mg/mL时，其OD值为0.822；山楂多糖的添加量为15 mg/mL时，其OD值为0.941；菊糖的添加量为2.5 mg/mL时，其OD值为0.861，而其枯草芽孢杆菌每OD的成本分别为 0.017153、0.004782、0.000238元， 而且这 3种多糖对枯草芽孢杆菌生长的影响几乎都表现为低浓度促进和高浓度抑制，这种趋势与李树鹏（2005）的报道相一致。从成本考虑方面来说，添加菊糖对枯草芽孢杆菌的增殖效益最好。不同种类和混合比例的植物多糖联合作用对于枯草芽孢杆菌的增殖效果的研究还鲜见报道，而这也是下一步试验所要研究的方向。

4 结论

在LB液体培养基中添加适宜香蕉多糖、山楂多糖和菊糖均可促进枯草芽孢杆菌的增殖，而50 mg/mL的山楂多糖对枯草芽孢杆菌增殖性能的影响效果最好。