郑梅 梁广忠 赵晓萌 孙雅娜 赵颖 杨振河

摘要：目的  探讨倒置显微镜下观察狗肾上皮细胞（MDCK）分离流感病毒状态变化，为科学防控流感提供技术支持。方法  选取天津市津南区疾病预防控制中心流感网络实验室于2018年10月11日～20日流感病毒检测阳性的咽拭子样本20例，接种到MDCK传代细胞中，于接种后使用倒置显微镜观察细胞形态变化，包括细胞肿胀、间隙增大、核固缩或破裂、细胞部分或全部脱落，用血凝实验方法测定MDCK细胞不同分离状态下的流感病毒滴度状况。结果  倒置显微镜可以观察到MDCK细胞分离流感病毒状态的变化，阴性对照与未出现倒置显微镜镜下病变的MDCK细胞不能使人“O”型红细胞凝集;出现病变的MDCK细胞可以使人“O”型红细胞凝集，产生HA滴度。结论  倒置显微镜在观察MDCK细胞分离流感病毒过程中起到重要作用，可提前判断病毒的滴度与活力，为科学防控流感提供技术支持。

关键词：倒置显微镜;流感病毒;MDCK细胞

中图分类号：R373.1                               文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.055

文章编号：1006-1959（2019）16-0163-02

Abstract：Objective  To investigate the changes of influenza virus status in dog kidney epithelial cells （MDCK） under inverted microscope and provide technical support for scientific prevention and control of influenza. Methods  20 cases of swallow swab samples with positive influenza virus detection were selected from the influenza network laboratory of Tianjin Jinnan District Center for Disease Control and Prevention from October 11 to 20， 2018. They were inoculated into MDCK passage cells and observed under inverted microscope after inoculation. Cell morphology changes， including cell swelling， gap enlargement， nuclear pyknosis or rupture， partial or total detachment of cells， blood clotting experiments were used to determine the influenza virus titer status of MDCK cells under different separation conditions. Results  Inverted microscope can observe the changes of MDCK cells in the state of influenza virus isolation. Negative control and MDCK cells without inverted microscopic lesions cannot agglutinate human "O" type red blood cells; MDCK cells with lesions can make human "O" type Red blood cells aggregate to produce HA titers. Conclusion  Inverted microscope plays an important role in the observation of MDCK cells in the isolation of influenza virus. It can judge the titer and vitality of virus in advance and provide technical support for scientific prevention and control of influenza.

Key words：Inverted microscope;Influenza virus;MDCK cells

流行性感冒（influenza），簡称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有高度传染性，可在人群中引起流行，是第一个实行全球监测的传染性疾病，多次引起世界性大流行[1]。主要传染源为流感患者和隐性感染者，飞沫传播为主要传播途径。其临床表现为急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。流感不仅会引起呼吸系统的损害，不及时治疗还可累及心血管、神经等系统。目前流感监测主要以狗肾上皮细胞（Madin-Darby canine kidney cell，MDCK）分离培养为主，是流感病毒检测的金标准[2]。流感病毒MDCK细胞分离培养的质量直接关系到流感监测效果，能否高效的分离流感病毒是流感监测的工作重点，也是流感病毒进行抗原分析和耐药分析的实验基础[3]。流感病毒MDCK细胞的分离状态观察主要依赖于倒置显微镜。本研究主要通过使用倒置显微镜观察流感病毒在MDCK细胞上的分离状态变化，为科学防控流感提供技术支持，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器  倒置显微镜，品牌型号为Nikon Eclipse TS100。

1.1.2试剂  DMEM培养基、胎牛血清、0.25% EDTA胰酶、HEPES、青链霉素、TPCK胰酶、人“O”型红细胞。

1.1.3细胞培养液成分  DMEM培养基，8.5%胎牛血清，青霉素、链霉素、HEPES终浓度分别为100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L，用 NaHCO3将pH值调整为7.0左右。

1.1.4流感病毒  由天津市津南区疾病预防控制中心流感网络实验室2018年10月11日～20日接收的流感样病例咽拭子样本经实时荧光定量PCR检测结果为阳性的咽拭子样本20例。

1.2方法  MDCK细胞瓶制备22瓶MDCK传代细胞备用。将流感病毒液接种MDCK细胞瓶内，置于35℃、5% CO2培养箱培养吸附2 h，吸去病毒液，用DMEM维持液洗一遍，每瓶加入5 ml DMEM维持液，置于35℃、5% CO2培养箱培养。维持液成份：MDEM培养基，青霉素、链霉素、HEPES、TPCK胰酶终浓度分别为100 U/ml、100 μg/ml、25 mmol/L、2 μg/ml，用 NaHCO3将pH值调整为7.2左右。

1.3观察指标  倒置显微镜下观察MDCK细胞分离流感病毒状态变化，分别取阴性对照、未出现病变的和病变出现的细胞培养上清液，用血凝实验测定病毒的血凝素抗原（HA）滴度。

2结果

2.1 MDCK细胞分离流感病毒状态变化  在倒置显微镜下观察细胞病变，阴性对照（图1）生长成片的MDCK细胞，成多边型;接种流感病毒但未出现病变的MDCK细胞（图2）生长状态与阴性对照类似;接种流感病毒出现明显细胞病变的MDCK细胞：细胞圆缩成圆形，折光性增强、细胞核固缩、碎片增多，直至成片脱落，仅存少量细胞生长于瓶底。病毒接种时间不同则细胞病变的程度不同。

2.2血凝实验结果  阴性对照与未出现倒置显微镜镜下病变的MDCK细胞不能使人“O”型红细胞凝集;出现病变的MDCK细胞可以使人“O”型红细胞凝集，产生HA滴度。

3讨论

倒置显微鏡能够供高校科研实验、医疗卫生单位等部门使用，可以用于细胞、微生物、细菌、组织培养、沉淀物、悬浮体等的观察，能够连续观察并拍摄记录细菌等生物在培养液中繁殖分裂的过程，在免疫学、细胞学、遗传工程学、肿瘤学、寄生虫学、工业 微生物学、植物学等各个领域发挥十分重要的作用[4]。

流感病毒最外层是HA，能与人、豚鼠、鸟等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血[5]，可以通过血凝实验判断培养物中是否存在流感病毒，HA滴度与流感病毒的多少呈正相关。流感病毒主要用MDCK细胞分离培养，为溶细胞型病毒，在感染细胞后，细胞开始凋亡，凋亡的细胞会从吸附的表面掉落，MDCK细胞细胞膜破裂，大量的流感病毒释放到培养上清液中，造成在血凝实验中测得到培养物上清液的良好HA滴度。HA滴度可以反映出病毒的毒力，而毒力决定其侵袭正常细胞的能力，病毒的毒力可以反映出病毒的复制能力。而流感病毒感染细胞后，细胞的凋亡过程可以使用倒置显微镜观察，根据镜下的状态可以预先判断细胞分离流感病毒的状况。

本研究通过使用倒置显微镜对MDCK传代细胞进行流感病毒接种观察细胞状态变化，可以验证MDCK细胞对流感病毒分离较敏感，分离过程细胞的状态可使用倒置显微镜观察，包括细胞肿胀、间隙增大、核固缩或破裂、细胞部分或全部脱落。本研究中观察到的细胞凋亡状况与血凝实验滴度结果相吻合，阴性对照细胞没有检测出流感病毒滴度，细胞脱落的程度与流感病毒血凝滴度的检出成正比。

综上所述，倒置显微镜在观察MDCK细胞分离流感病毒过程中起到重要作用，可提前判断病毒的滴度与活力，为科学防控流感提供技术支持。

参考文献：

[1]郭丽茹，孔梅，李晓燕，等.2010年-2013年天津市流感病原学监测分析[J].中国卫生检验杂志，2013，23（13）：2795-2797.

[2]董晓春，李琳，徐文体，等.流感病毒MDCK细胞分离阳性率的影响因素分析[J].中国卫生检验杂志，2014，24（11）：1582-1583，1587.

[3]马萍，李欣玥.流感病毒在狗肾上皮细胞上的最优培养条件[J].现代预防医学，2017，44（23）：4326-4331.

[4]崔志英.倒置显微镜技术发展趋势[J].科技传播，2016，8（13）：148-149.

[5]许沙沙，田鹏，曹开源.甲型流感病毒的研究进展[J].热带医学杂志，2015，15（10）：1450-1452，1455.

收稿日期：2019-3-6;修回日期：2019-3-26

编辑/杜帆