刘 玮, 宗佩君， 刘珊珊

(1潍坊护理职业学院病理教研室， 山东 青州 262500； 2潍坊市益都中心医院病理科， 山东 潍坊 261000)

动脉粥样硬化是一种涉及脑动脉、冠状动脉和主动脉等血管组织损伤的病理过程，其可以诱发血管管壁破裂、管腔闭塞等导致心肌梗死和中风等疾病的发生，血管内皮细胞损伤发生于动脉粥样硬化的早期，血管内皮细胞过度凋亡是造成血管组织正常功能缺失的重要原因，另外，血管内皮细胞在动脉粥样硬化过程中分泌大量的炎症因子，这些炎症因子可以刺激正常的组织和细胞，加快动脉粥样硬化的发生[1-3]。热休克转录因子1(heat shock tran-scription factor 1，HSF1)是存在于哺乳动物体内的HSF亚型，其是调节应激反应的转录调控因子，其不仅参与热休克反应，还参与组织发育和生殖等过程，HSF1具有抗炎、抗凋亡等作用，HSF1在动脉粥样硬化斑块组织中代偿性的高表达，HSF1具有降低氧化应激条件下血管内皮细胞凋亡的作用，在内皮细胞氧化损伤中发挥保护作用，对于HSF1在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)诱导的血管内皮细胞损伤中的作用尚不明确[4]。本实验通过上调血管内皮细胞中HSF1的表达水平，探讨HSF1在AngⅡ诱导的血管内皮细胞损伤中的作用，为明确HSF1在动脉粥样硬化中的作用奠定基础。

材 料 和 方 法

1 材料

人脑微血管内皮细胞HBMEC-2购自ATCC。抗HSF1抗体购自Santa Cruz Biotechnology；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量检测试剂盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)检测试剂盒和白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量检测试剂盒购自eBioscience；pcDNA3.1-HSF1由广州辉骏生物科技有限公司构建；抗CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologus protein，CHOP)抗体、抗cleaved caspase-3抗体和抗活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)抗体购自上海钰博生物科技有限公司；一氧化氮(nitric oxide，NO)检测试剂盒、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)含量检测试剂盒和内皮素1(endothelin-1，ET-1) 检测试剂盒购自Roche；AngⅡ购自Sigma。

2 方法

2.1细胞转染和分组 血管内皮细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM中。血管内皮细胞中转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1，记为pcDNA3.1组和pcDNA3.1-HSF1组；用含有10-5mol/L的AngⅡ细胞培养液培养转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1的血管内皮细胞，记为pcDNA3.1+AngⅡ组和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ组；用含有10-5mol/L的AngⅡ细胞培养液培养未做转染的血管内皮细胞记为AngⅡ组；把0 mol/L的AngⅡ细胞培养液培养的未做转染的血管内皮细胞记为对照(control)组。各组细胞在培养24 h，进行后续实验检测。pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1转染方法同Lipofectamine2000，用G418筛选稳定转染的细胞用于后续实验。

2.2过表达效果的检测 RT-qPCR检测mRNA表达水平：control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各组细胞按照细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，按照SYBR RT-qPCR试剂盒进行PCR，HSF1的上游引物序列为5′-GGAAAGCTGTCCGCTGATGG-3′， 下游引物序列为5′-GCTGGAGATGGAGCTGAGTA-3′。β-actin的上游引物序列为5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′， 下游引物序列为5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。结果按照2-ΔΔCt法计算，以β-actin作为内参照。

Western blot检测蛋白表达水平：control、pcDNA3.1和pcDNA3.1-HSF1各组细胞用含有PMSF的RIPA裂解液提取蛋白以后，经BCA法对蛋白样品定量，进行SDS-PAGE，每个泳道添加20 μg蛋白样品，在浓缩胶中的电压为100 V，观察染料到达分离胶和浓缩胶的交接处，把电压调整到120 V，观察染料进入底部边缘，停止电泳。进行转膜，转膜电压设置为90 V，转膜80 min后，把NC膜取出，经5%牛血清白蛋白室温封闭以后，与抗HSF1和内参照β-actin的抗体反应后，与HRP标记的 II 抗反应，经ECL法显色后，根据灰度值分析HSF1表达水平。抗HSF1的抗体稀释倍数为1∶400，抗β-actin抗体的稀释倍数为1 ∶1 000。

2.3LDH、NO和ET-1分泌水平的检测 将control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各组细胞按照上述方法培养24 h以后，收集培养液上清，分别检测培养液中LDH(二硝基苯肼法)、NO(硝酸还原酶法)和ET-1(ELISA法)水平，步骤均同试剂盒说明书。

2.4细胞凋亡的检测 将control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各组细胞按照上述方法培养24 h以后，收集细胞，以500 μL的结合缓冲液悬浮后，添加PI和annexin V-FITC染液，用流式细胞术检测凋亡变化。

2.5细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β水平的检测 将control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各组细胞按照上述方法培养24 h以后，收集各组细胞培养液上清，用ELISA法检测TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，步骤同试剂盒操作说明。

2.6细胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3蛋白水平检测 将control、AngⅡ、pcDNA3.1+AngⅡ和pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ各组细胞按照上述方法培养24 h以后，用Western blot检测细胞中CHOP、ATF6和cleaved caspase-3的蛋白水平，步骤同2.2。

3 统计学处理

实验数据用SPSS 21.0软件分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 pcDNA3.1-HSF1提高血管内皮细胞中HSF1的表达水平

转染pcDNA3.1-HSF1能够明显提高血管内皮细胞中HSF1的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of HSF1 at mRNA and protein levels in transfected vascular endothelial cells. A: the mRNA expression of HSF1 was detected by RT-qPCR; B: the protein expression of HSF1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspcDNA3.1 group and control group.

图1 HSF1在转染后的血管内皮细胞中的表达

2 过表达HSF1减少AngⅡ处理后的血管内皮细胞分泌LDH

AngⅡ处理后的血管内皮细胞分泌的LDH增多；过表达HSF1后的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞分泌的LDH减少(P<0.05)，见表1。HSF1具有降低AngⅡ诱导的血管内皮细胞损伤的作用。

3 HSF1对AngⅡ处理后血管内皮细胞分泌NO和ET-1水平的影响

AngⅡ处理后的血管内皮细胞分泌的NO含量降低，ET-1含量升高;高表达HSF1后的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞分泌的NO含量升高，ET-1含量降低(P<0.05),见表1。HSF1具有改善AngⅡ处理后血管内皮细胞分泌血管活性物质的作用。

表1 过表达HSF1的血管内皮细胞经AngⅡ诱导后细胞分泌LDH、NO 与ET-1水平的比较

Table 1.The effects of HSF1 over-expression on the secretion of LDH, NO and ET-1 in vascular endothelial cells induced by Ang II (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (U/L)NO (μmol/L)ET-1 (ng/L) Control81.45±8.320.47±0.0650.41±6.32 AngⅡ225.48±17.26*0.20±0.02*95.26±7.51* pcDNA3.1+AngⅡ217.40±22.810.19±0.0394.20±8.32 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ125.87±10.95&0.36±0.03&75.36±6.20&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

4 过表达HSF1降低AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡水平

AngⅡ处理后的血管内皮细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高；过表达HSF1后的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，见图2。HSF1可降低Ang Ⅱ诱导的血管内皮细胞的凋亡水平。

Figure 2. The effects of HSF1 over-expression on the apoptosis of vascular endothelial cells induced by Ang II. A: the results of flow cytometry for analyzing the effect of HSF1 over-expression on Ang II-induced apoptosis of vascular endothelial cells; B: the results of Western blot for determining the effects of HSF1 over-expression on the protein level of cleaved caspase-3 in vascular endothelial cells induced by Ang II. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

图2 过表达HSF1的血管内皮细胞经AngⅡ诱导后细胞的凋亡情况

5 过表达HSF1减少AngⅡ诱导的血管内皮细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β

AngⅡ处理后的血管内皮细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β增多；过表达HSF1后的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β减少(P<0.05)，见表2。HSF1具有降低AngⅡ诱导的血管内皮细胞分泌炎症因子的作用。

表2 过表达HSF1对血管内皮细胞经AngⅡ诱导后细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响

Table 2.The effects of HSF1 over-expression on the levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β secreted by vascular endothelial cells after Ang II induction (Mean±SD.n=3)

GroupTNF-α (ng/L)IL-6 (ng/L)IL-1β (ng/L) Control332.47±25.159.82±0.961 542.69±158.20 AngⅡ528.14±62.85*35.20±3.59*2 178.63±163.18* pcDNA3.1+AngⅡ520.17±55.8236.81±4.922 165.04±147.53 pcDNA3.1-HSF1+AngⅡ410.25±41.87&20.58±3.20&1 856.22±114.10&

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

6 HSF1减少AngⅡ诱导的血管内皮细胞中CHOP和ATF6蛋白表达

AngⅡ处理后的血管内皮细胞中CHOP和ATF6蛋白水平增多；过表达HSF1后的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞中CHOP和ATF6蛋白水平减少(P<0.05)，见图3。HSF1具有抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞内质网应激的作用。

Figure 3.The effects of HSF1 over-expression on the protein levels of CHOP and ATF6 in vascular endothelial cells after Ang II induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAngⅡ group and pcDNA3.1+AngⅡ group.

图3 过表达HSF1对血管内皮细胞经AngⅡ诱导后细胞中CHOP和ATF6蛋白水平的影响

讨 论

动脉粥样硬化的发生是一种慢性的炎性、免疫性疾病，其与内皮细胞等多种细胞损伤有关，AngⅡ是动脉粥样硬化发生的促进因子，其可以造成血管内皮细胞损伤，诱导血管组织功能异常[5-6]。AngⅡ能够增加血管内皮的通透性，引起细胞因子和炎症因子等的表达，灭活NO，引起内皮细胞凋亡发生[7]。ET-1和NO是维持血管功能的细胞因子，内皮细胞受到损伤时，舒血管物质NO分泌水平减少，而缩血管物质ET-1分泌水平增加[8-10]。本实验的结果表明，AngⅡ处理后的血管内皮细胞中释放的LDH水平升高，分泌的NO含量降低，ET-1分泌水平升高，说明AngⅡ能够引起血管内皮细胞损伤，动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤模型构建成功。

血管内皮细胞过度凋亡是动脉粥样硬化发生的重要原因之一，AngⅡ作为动脉粥样硬化发生的诱导因子，其可以促进血管内皮细胞凋亡，致使血管组织完整性受到破坏[11]。Caspase是参与细胞凋亡发生的关键蛋白家族之一，其可以被细胞内的内质网应激激活，诱导caspase蛋白成员激活，促进细胞凋亡发生，caspase-3是细胞凋亡的执行因子，其位于caspase凋亡反应的下游，caspase-3活化水平的高低是细胞凋亡水平的标志[12-13]。CHOP和ATF6是细胞内质网应激的标志蛋白，二者表达水平升高可以激活细胞内质网应激，诱导caspase凋亡反应发生[14-15]。HSF1的抗细胞凋亡作用目前在肿瘤细胞、内皮细胞等多种细胞中已经被证实[16-18]。本研究显示，高表达HSF1的血管内皮细胞在AngⅡ处理后，细胞凋亡减少，细胞中活化的caspase-3蛋白水平降低，内质网应激蛋白CHOP和ATF6表达水平也下降，说明HSF1能够抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡和内质网应激。

炎症因子是动脉粥样硬化发生的促进因子，血管内皮细胞和巨噬细胞等都可以分泌炎症因子，动脉粥样硬化时，过量的炎症因子可以损伤周围的正常组织和细胞，引起细胞凋亡发生[19-20]。TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子具有促进炎症的作用，其在动脉粥样硬化组织中表达上调，AngⅡ能够诱导血管内皮细胞分泌炎症因子[21]。研究显示，内质网应激不仅可以诱导细胞凋亡的发生，还可以诱导细胞炎症反应[22]。HSF1是一种重要的炎症调控因子，在巨噬细胞、心肌细胞、内皮细胞等炎症反应中发挥抑制作用[20-23]。本研究显示，高表达HSF1的血管内皮细胞经AngⅡ处理后，细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β减少，HSF1具有抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞炎症因子分泌的作用。

总之，HSF1在AngⅡ诱导的血管内皮细胞损伤中发挥保护作用，高表达HSF1能够减少AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡和炎症因子分泌，作用机制可能与降低细胞内质网应激有关。HSF1在动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤中发挥抑制作用，对于其具体的作用机制尚不清楚，在以后的实验中会进行深入探讨。